论文摘要
在微生物来源的新药筛选中,分离得到的绝大多数菌株经发酵培养和活性筛选往往因无活性而被大量闲置或销毁,造成前期投入和付出的极大浪费。如何有效地再次开发利用这些无活性菌株资源,成为具有重要意义的研究课题。本文利用抗生素抗性筛选以及将抗生素抗性筛选与化学诱变结合的组合抗性筛选技术,结合使用体外抗肿瘤活性筛选模型,开展了由无活性放线菌筛选获取活性突变株从而拓展放线菌药源活性菌株资源的研究。内容主要包括:海洋微生物野生菌株的分离培养及其抗肿瘤活性筛选;无活性放线菌的抗生素抗性筛选与抗性突变株中抗肿瘤活性菌株的筛选获取;活性突变株发酵产物中与原始菌有差异产物的跟踪分离与单体化合物的结构解析及其抗肿瘤活性初步评价等。1.海洋微生物野生菌株的分离培养及其抗肿瘤活性筛选从渤海湾潮间带海泥样品中分离得到海洋微生物野生菌株155株,其中真菌29株、放线菌126株。采用MTT法,以人白血病K562细胞为受试细胞,经初筛和复筛得到在100μg/mL浓度下对K562细胞的抑制率大于20%的活性菌株20株（其中放线菌17株、真菌3株）,阳性率达15.9%。同时还得到即使在1000μg/mL浓度下在初筛和复筛中对K562细胞的抑制率均小于6%的无活性菌株19株（均为放线菌）。部分活性菌株已直接用于活性产物研究,这些活性菌株为寻找抗肿瘤活性先导化合物提供了菌株资源。同时,筛选得到的无活性菌株则为二次开发无活性菌株从而拓展药源微生物活性菌株资源的相关研究提供了大量原始菌株。2.无活性放线菌的抗生素抗性筛选与突变株的抗肿瘤活性筛选选择两株无活性放线菌L35-1（1000μg/mL浓度下对K562细胞的抑制率为2.8%）和L8-5x（1000μg/mL浓度下对K562细胞的抑制率为4.8%）为原始菌株,采用引入抗生素抗性以及化学诱变联合抗性筛选的方法,在测定抗生素MIC值的基础上,用含有大于MIC的不同浓度抗生素的平板培养基进行了抗性筛选,从而得到抗生素抗性突变株444株。对其中324株进行了发酵培养和抗肿瘤活性筛选,得到在1000μg/mL浓度下对K562细胞的抑制率大于20%的突变株127株（其中100μg/mL浓度下抑制率大于20%的突变株14株）。与原始菌相比,这些突变株发酵样品呈明显的抗肿瘤活性。通过系统考察抗生素浓度对获取活性突变株得率的影响,发现从高浓度抗生素抗性突变株中获得活性突变株的得率高于低浓度抗生素抗性突变株,这在样本量较大的新霉素抗性突变株中尤为明显。与母株相比,活性突变株在菌落形态、孢子颜色以及代谢产物的TLC斑点等外观特征上都有显著的差异。这些研究结果表明,在相同生物活性筛选指标下,通过对无活性放线菌进行抗生素抗性与活性筛选,转化获取活性突变株,从而拓展药源活性菌株是可行的。3.活性突变株发酵产物中与原始菌相比有差异的代谢产物的研究选择由无活性放线菌L35-1经新霉素抗性筛选获取的突变株Csn8-15和经化学诱变组合链霉素抗性筛选获取的突变株D2S4-1为目标菌株。根据时效关系考察结果,研究确定最佳发酵条件,并在同样条件下对原始菌和目标菌进行了发酵。经对发酵物分别按相同方法提取处理,得到原始菌和突变株的相应提取物。活性测试结果表明突变株提取物有活性,而原始菌提取物则无活性。根据薄层层析分析结果,分离纯化突变株代谢产物中与原始菌L35-1相比有差异的化学成分,从中分离得到6个单体化合物,并利用波谱学方法分别鉴定为1,9-二甲酯吩嗪（1）、2-羟基苯胺乙酰（2）、2-吡咯甲酸（3）、大豆黄素（4）、环（4-羟基-脯氨酸-亮氨酸）二肽（5）和尿嘧啶（6）。薄层层析比较分析结果表明,这些化合物均为原始菌发酵物中没有的突变株新代谢产生的化合物。抗肿瘤活性测试结果表明,化合物1、5和6有一定抗肿瘤活性,在100μg/mL浓度下对K562细胞的抑制率分别为33.3%、33.5%和20%。在上述6个化合物中,化合物1为新天然产物,其抗肿瘤活性亦属首次筛选发现。综上,本论文从渤海湾海泥样品中分离得到野生菌株155株,并经抗肿瘤活性筛选,从中获得野生型活性菌株20株和大量的无活性菌株。选择2株无活性放线菌,采用组合抗生素抗性筛选方法,得到抗性突变株444株,经对其中324株进行发酵培养与活性筛选,得到在100μg/mL样品浓度下对K562细胞的抑制率大于20%的抗肿瘤活性突变株14株。选择其中2株活性突变株,对与原始菌相比有差异的代谢产物进行了跟踪分离、结构鉴定与抗肿瘤活性测试,结果阐明了6个原始菌产物中没有的化合物,其中3个为抗肿瘤活性产物,1个为新天然产物,其抗肿瘤活性也属首次筛选发现。总之,本论文上述研究是在崭新研究思路指导下开展的新的研究工作。上述论文研究结果表明,开发利用抗生素抗性筛选组合新技术方法,来二次开发无活性放线菌菌株资源,从而拓展药源微生物活性菌株来源是可行的。