论文摘要
研究背景冠状动脉粥样硬化性心脏病（Coronary Atherosclerosis heart disease，CHD）是目前人类发病率最高、危害最大的疾病之一。其发病机理非常复杂，对CHD发病机制的研究及其防治策略是当今医学领域的重要课题之一。曾有多种学说从不同角度来阐明CHD的病因，新近有学者发现自身免疫在CHD中可能发挥着重要作用，CHD符合自身免疫性疾病（autoimmune disease，AID）有以下条件：①在CHD患者的血液及受累的组织中存在炎性递质或免疫物质；②在CHD患者体内检出自身抗体；③在受累组织中可见参与自身免疫的特异细胞，如T淋巴细胞。抗原提呈细胞（antigen-presenting cell，APC）是指能捕捉、加工、处理抗原，并将抗原提呈给抗原特异性淋巴细胞的一类免疫细胞，根据细胞表面是否组成性表达MHC-Ⅱ类抗原和其他参与T细胞激活的协同刺激分子，可将APC分为专职和兼职两类，淋巴细胞与APC直接接触则是启动免疫应答的起始环节。DC是目前发现的机体内功能最强的专职抗原提呈细胞，极少量的DC即可强烈激活T淋巴细胞启动特异性细胞免疫反应，其激活T淋巴细胞的能力是巨噬细胞或B细胞的100～10000倍，T淋巴细胞的激活在CHD起始和斑块的稳定性中起重要的作用。氧化低密度脂蛋白（Oxidized low density lipoprotein，Ox-LDL）最初因为其较低密度脂蛋白（Low density lipoprotein，LDL）有更强的致泡沫细胞作用及细胞毒性，成为CHD研究的热点，后继的研究发现，LDL在氧化过程中伴随着一系列的脂质及蛋白的分解和重新组合过程，产生新的表位，具有类似异体蛋白的免疫原性。已有的临床研究发现Ox-LDL除了损伤内皮细胞和平滑肌外，还对其他的单核细胞具有趋化性能。Ox-LDL与DC清道夫受体结合后，可以形成泡沫细胞，启动包括产生炎性细胞因子在内的一连串细胞内事件，触发和放大炎症反应。Ox-LDL免疫原性的作用多集中在引起血管内皮细胞CD40／CD40L的高表达上，关于Ox-LDL对于DC的作用机制目前尚无定论。他汀类药物用于治疗CHD已有肯定的疗效，其药理机制是竞争性抑制3-羟基3-甲基戊二酰辅酶A（3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A，HMG-CoA）还原酶抑制剂，抑制甲羟戊酸的产生，从而抑制胆固醇合成。阿托伐他汀是最新一代HMG-CoA还原酶抑制剂，一系列大型一、二级冠心病预防研究结果均显示阿托伐他汀类药物对血脂紊乱及冠状动脉事件危险性的理想防治效果，降脂益处已无可争辩。近年来，阿托伐他汀的非调脂作用越来越引起关注，临床研究发现，心脏移植患者经阿托伐他汀治疗后，1年成活率明显增加，移植血管病事件和急性重症移植排斥事件明显减少，提示阿托伐他汀类药物具有免疫调节作用。Hwang等给予高胆固醇血症患者阿托法他汀治疗后，CD40L和P-选择素水平显著降低，明显抑制CD40／CD40L系统的高表达作用，这恰好与Ox-LDL免疫原性的作用相反，从而肯定了阿托法他汀的免疫调节作用。本实验拟在细胞生物学、分子免疫水平，观察在冠心病发病重要因素之一的Ox-LDL刺激下，DC成熟及免疫功能的变化；探讨在最强的专职抗原提呈细胞—DC途径上免疫调节作用，从而为临床防治CHD提供免疫学理论。目的1、探讨Ox-LDL对DC成熟及免疫功能的影响。2、探讨阿托伐他汀对Ox-LDL作用下的DC成熟和免疫应答反应的调节作用。对象与方法1、对象门诊体检健康人20例，男性12例，女性8例，平均年龄（40.5±8.7岁）。取其外周血20ml。2、方法2．1 Ox-LDL的制备与DiⅠ标记采用超高速密度梯度离心法从健康人新鲜血液分离出LDL，测定蛋白含量，并将蛋白终浓度调整为500ug／mL，加入终浓度为10mmol／mL的CuSO4溶液中氧化，在终溶度为100μmol／L的EDTA溶液中终止氧化，获得Ox-LDL，以DiⅠ标记Ox-LDL备用。2．2 DC的培养及干预淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离出外周血单个核细胞（PBMC），用完全RPMI1640（含10％FCS，rhGM-CSF 100万单位／L，rhIL-4 50万单位／L）培养液，置CO2孵箱中培养5天，给予分组干预后，继续培养48h后，收集DC细胞，培养过程中以倒置显微镜观察细胞形态学变化。2．3实验分组：（1）对照组：无干预因素培养（2） Ox-LDL组：Ox-LDL与DC共同培养48h（3）阿托伐他汀组：阿托伐他汀+Ox-LDL与DC共同培养48h2．4混合T淋巴细胞增值反应：以DC为刺激细胞，测定DC刺激同种异体T淋巴细胞增殖情况。2．5流式细胞学（FACS）分析：收集DC细胞，用流式细胞仪检测DC表面相关分化抗原的表达情况。2．6 IL-12浓度的检测：ELISA双抗夹心法检测。3、统计学方法：应用SPSS13.0软件系统分析，所有计量资料以均数±标准差（（?）±s）表示，比较采用配对t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。结果1、DC形态学上的观察：倒置相差显微镜下，（1） PBS组：培养第5天，树突样结构清晰，胞质丰富：（2）Ox-LDL组：DC与DiⅠ标记的Ox-LDL共同孵育48h后，DC逐渐发育变大，胞浆逐渐丰富，变的红染，呈不规则多型状态，并有较多伪足伸出，表现出树突形状；（3）阿托伐他汀组：阿托伐他汀与DC及DiⅠ标记的Ox-LDL共同孵育48h后，吞噬Ox-LDL的DC数目减少，且胞浆红染程度减轻。2、混合T淋巴细胞反应：Ox-LDL干预后DC刺激T淋巴细胞增值反应增强，Ox-LDL组的A值是（3.9±0.8）与对照组（1.1±0.3）比较，P=0.000，差异有统计学意义：而阿托伐他汀和Ox-LDL共同干预DC后T淋巴细胞增值反应减弱，阿托伐他汀和Ox-LDL组的A值为（1.2±0.4）与Ox-LDL组比较，P=0.000，差异有统计学意义。3、表型的影响收集干预48h的悬浮细胞，经FACS分析显示，与对照组相比，经Ox-LDL处理的DC其表面分子CD1a和HLA-DR的表达增加，均可刺激T淋巴细胞增值，与对照组比较[（64.5±18.2）vs（40.1±17.2）P=0.000]和[（89.8±5.7）vs（69.9±17.7）P=0.000]差异均有统计学意义；CD80和CD86的表达虽有轻度的增加，但与对照组比较分别为[（72.5±1.9）vs（60.7±23.8）P=0.063]和[（66.5±18.4）vs（74.9±18.6）P=0.159]差异尚无统计学意义。而阿托伐他汀处理的DC与Ox-LDL组比较其表面分子的表达CD1a和HLA-DR的表达明显减少，与Ox-LDL组比较分别为[（55.2±12.7）vs（64.5±18.2）P=0.038]和[（89.8±57）vs（71.0±11.6）P=0.000]，差异有统计学意义。结论1、外周血PBMC中的贴壁细胞培养7天后，在含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、白介素4（IL-4）条件下培养，均可成功诱导为DC。2、Ox-LDL与DC共同孵育后，可使DC表面MHC-Ⅱ类分子高表达，从而具有较强的摄取抗原的能力，激活未致敏的T细胞，启动初次免疫应答。3、阿托伐他汀依赖性地抑制Ox-LDL引起的生物学效应及可能的细胞内信号转导，可明显抑制DC的免疫活性，这推测是他汀类药物免疫调节治疗冠心病的新机制。
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标签：阿托伐他汀论文; 树突状细胞论文; 氧化低密度脂蛋白论文; 免疫功能论文;