论文摘要
Cre-loxP系统介导的条件性基因敲除（conditional gene knockout）是基因功能研究最重要的技术之一,它克服了传统基因敲除导致小鼠胚胎死亡等诸多弊端。将该技术应用于神经系统,可使基因敲除仅发生于大脑的某个亚区或发育过程的某个阶段,以便对小鼠大脑基因功能进行精细研究。对于神经系统条件性基因敲除而言,选择一个大脑亚区和时间特异性启动子指导Cre的表达是至关重要的。许多研究表明,CaMKⅡα基因的表达具有较强的时间和空间特异性[1-4],因此,符合制备前脑神经细胞特异性表达Cre转基因小鼠的要求。本研究通过克隆和鉴定CaMKⅡα基因5’端不同调节区的序列,构建了两个神经细胞特异性表达Cre的真核表达载体,并对这两个载体的转录活性进行了初步研究。为建立前脑神经细胞特异性表达Cre的转基因小鼠及进一步制备ADAM10基因条件性敲除的小鼠奠定了基础,有助于开展阿尔茨海默病发病机制的研究。运用PCR技术,从C57BL/6J小鼠基因组中分步扩增了CaMKⅡα基因5’端两段调控序列,长度分别为5.26kb和8.1kb。经部分测序鉴定后,将片段分别连接于pCre-EGFP载体的Cre基因上游,构建了神经细胞特异性表达Cre重组酶的表达载体pCaMKⅡα-Cre-EGFPⅠ（pCCEⅠ）和pCaMKⅡα-Cre-EGFPⅡ（pCCEⅡ）。取C57BL/6J新生鼠与4周龄小鼠的端脑与海马进行神经元的原代培养。分别以pCCEⅠ和pCCEⅡ为实验组,pCre-EGFP为阳性对照组,采用脂质体2000（LP2000）转染神经细胞、小鼠神经瘤与大鼠神经胶质瘤之融合细胞（NG108-15）和人乳腺癌细胞（ZR-75-30）,研究pCCEⅠ和pCCEⅡ的表达活性及其组织特异性。结果显示,克隆的两个CaMKⅡα基因5’端侧翼区片段的酶切图谱与公布的C57BL/6J小鼠相应序列的酶切位点相一致,测序结果表明,所测序列与数据库公布的C57BL/6J小鼠相应序列基本相同,仅在-940bp（A→C）和-1.4kb（A→G）两处存在差异。其中,文献报道的富含顺式调控元件的-900bp内序列[5]与公布的C57BL/6J小鼠序列完全一致。5.26kb与8.1kb这两段CaMKⅡα基因启动子均正确地连接于Cre基因的5’端,成功构建了目标载体。新生鼠神经细胞的原代培养表明,细胞数量多（35mm培养皿中细胞密度≧106/cm3）,细胞形态好。4周龄鼠神经细胞的原代培养细胞形态较典型,但细胞数量很少（35mm培养皿中细胞不超过300个）。用LP2000转染后,在NG108-15细胞中,pCCEⅠ组能表达绿色荧光（表达率低）,pCCEⅡ组不表达绿色荧光,阳性对照组表达绿色荧光;在ZR-75-30细胞中,pCCEⅠ组和pCCEⅡ组都不表达绿色荧光,阳性对照组表达绿色荧光;在新生鼠神经细胞中,pCCEⅠ组和pCCEⅡ组都不表达绿色荧光,阳性对照组表达绿色荧光（转染效率低）;在4周龄鼠神经细胞中,由于细胞数量少,培养困难,经LP2000处理后即发生死亡,故实验组与阳性对照组均未表达绿色荧光。综上所述,得出以下结论:本研究成功构建并鉴定了神经细胞特异性Cre表达载体（pCCEⅠ和pCCEⅡ）。成功培养了新生鼠与4周龄鼠的皮质及海马神经细胞。pCCEⅠ能在神经细胞瘤-神经胶质瘤细胞NG108-15中表达绿色荧光,说明pCCEⅠ的启动子CaMKIIα基因5.26kb片段具有启动转录的活性;pCCEⅠ和pCCEⅡ在人乳腺癌细胞ZR-75-30中不表达,支持了其表达的神经细胞特异性;pCCEⅠ和pCCEⅡ在新生鼠神经细胞中不表达,一定程度上支持了其表达的时间特异性。pCCEⅡ中包含的CaMKIIα基因几乎所有调控区的8.1kb片段的转录活性尚有待体内实验的证实。实验结果证明本研究所构建的神经细胞特异性表达Cre的转基因载体pCCEⅠ具有转录活性,且支持其表达的时空特异性。理论上证明了建立前脑神经细胞特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠的可行性。
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