病原物对松墨天牛（Monochamus alternatus）致病性的研究

论文摘要

松墨天牛（Monochamus alternatus）是我国重要的林业害虫,除取食危害马尾松（Pinus massoniana Lamb）、油松（Pinus tabulae formis Carr）等松树外,还传播松材线虫病（Bursaphelenchus xyphduslo）,已对我国松树造成严重危害。微孢子虫是专性细胞内寄生的单细胞原生动物,是一类重要的昆虫病原微生物,它主要寄生在昆虫体内,通过水平传播和垂直传播引起昆虫疾病的发生与流行,是自然界中制约昆虫种群密度的重要因素之一。作为一种生物杀虫剂,它能持续控制害虫并对环境安全。但国内外尚无运用微孢子虫防治天牛的报道。白僵菌是一类重要的生防真菌,在生产上应用广泛,防治松墨天牛在生产上也早有应用,目前多利用其孢子粉剂或液剂,但存在施用方法不便和防治效果容易受外界环境的影响等局限性,在应用中受到很大限制。 本研究主要包括两个方面:1) 以从松墨天牛体内分离到的一种微粒子虫为研究对象,观察其形态特征,超微结构、明确其分类地位,调查了其野外流行情况,以期为松墨天牛的生物防治提供理论与实践依据。2) 从白僵菌中寻找对松墨天牛有毒杀作用的蛋白,该研究可从生物化学和分子生物学的角度揭示虫生真菌的致病机理,同时为培育抗天牛苗木奠定基础。 通过对分离出的微孢子虫的形态和超微结构观察认为其应归于微粒子属,命名为松墨天牛微粒子虫（Nosema alternatus Zhang）;野外调查证明不同地点松褐天牛均有不同程度的微粒子虫感染,说明其广泛存在于自然界,是昆虫的制约因子之一。 选取12株有代表性的白僵菌菌株,通过室内接种松褐天牛筛选出对松褐天牛高毒力的两个菌株,Bb6和Bb8,两个菌株在25℃下对松褐天牛的致死中浓度分别是3.34×107孢子/ml和5.76×107孢子/ml;比较了菌株Bb6接种松褐天牛后天牛体内酯酶同工酶谱变化,松墨天牛感染Bb6后其酯酶谱明显增加1条E5酶带,E1、E2、E3、E4酶带比健虫的相应酶带颜色深,说明Bb6可明显引起松墨天牛幼虫的身体病变,而致其酯酶同工酶发生了变化;用硫酸铵沉淀浓缩、透析的方法提取了Bb6胞外全蛋白提取液,再通过制备电泳和洗脱凝胶的方法从胞外全蛋白提取液中分离纯化出了5种单一蛋白。 通过对5种单一蛋白的生测,筛选出1种高毒性蛋白,松墨天牛幼虫经毒蛋白处理后,前期多表现为拒食,而后行动迟缓、不爱活动,在饲料中的钻蛀活动明显减少,多数时间停卧在饲料中不动,死亡前多从饲料中钻出,在饲料表面痉挛、抽搐,不久死亡。刚死亡的幼虫体色正常无明显症状,死亡后1～2天内虫体软化、变褐、变黑。有些试虫经毒蛋白处理后虽然未死亡但不能正常化蛹,化蛹为畸形,不能羽化,羽化出的成虫不正常。 毒性最强的蛋白Bb6W-D经SDS-PAGE电泳后解离为2个亚基,分子量较大的一个为大亚基,较小的一个为小亚基。经SDS-PAGE电泳测定,大亚基的分子量约为24kD,小亚基的分子量约为17kD;经等电聚焦电泳测定,大亚基的pI为9.59,小亚基的pI为9.40。该蛋白N-末端起始的10个氨基酸序列为:E→P→M→G→I→P→G→E→P→T

论文目录

• 摘要
• 1 文献综述
• 1.1 松墨天牛
• 1.1.1 松墨天牛的生物学特性
• 1.1.2 松墨天牛的危害与防治
• 1.2 微孢子虫
• 1.2.1 昆虫微孢子虫的分类
• 1.2.2 致病机理
• 1.2.3 传播途径
• 1.2.4 人工增殖
• 1.2.5 应用
• 1.2.5.1 应用蝗虫微粒子虫防治害虫
• 1.2.5.2 玉米螟微粒子虫防治玉米螟、云南松毛虫
• 1.2.5.3 按蚊微粒子虫防治蚊虫
• 1.2.5.4 粘虫变形微粒子虫防治害虫
• 1.2.5.5 菜心野螟（Hellula undalis）的一种微孢子虫
• 1.2.5.6 微孢子虫防治火蚁（Solenopsis invicta）
• 1.2.5.7 其它应用探索
• 1.2.6 展望
• 1.3 虫生真菌和白僵菌
• 1.3.1 主要的虫生真菌
• 1.3.2 白僵菌生物学特性
• 1.3.3 白僵菌的致病机理
• 1.3.4 虫生真菌毒素
• 1.3.4.1 低分子量毒素
• 1.3.4.2 高分子蛋白毒素
• 1.3.5 虫生真菌产毒素的适宜培养条件
• 1.3.6 虫生真菌毒素的提取纯化
• 1.3.6.1 破坏素的提纯
• 1.3.6.2 白僵菌素的纯化
• 1.3.6.3 高分子蛋白毒素的分离
• 1.3.7 虫生真菌毒素的生物测定
• 1.3.8 虫生真菌毒素的致病机理
• 1.3.9 虫生真菌毒素研究中存在的问题及前景展望
• 1.3.9.1 存在的问题
• 1.3.9.2 前景展望
• 2 引言
• 3 材料和方法
• 3.1 供试虫饲养及观察
• 3.1.1 供试虫源及饲养材料
• 3.1.2 饲养及观察方法
• 3.2 微粒子虫及白僵菌分离纯化方法
• 3.2.1 微孢子虫及白僵菌来源
• 3.2.2 微粒子虫分离纯化方法
• 3.2.3 白僵菌分离纯化方法
• 3.3 微粒子虫形态观察
• 3.3.1 光镜观察
• 3.3.2 电镜观察
• 3.4 微粒子虫感染松墨天牛野外流行调查
• 3.5 对松墨天牛高毒力的白僵菌菌株的筛选
• 3.5.1 试虫的预处理
• 3.5.2 初筛的生物测定
• 3.5.3 复筛的生物测定
• 3.6 白僵菌菌株Bb6感染松墨天牛后体内酯酶同工酶比较
• 3.6.1 菌株及方法
• 3.6.2 酯酶的提取
• 3.6.3 制备PAGE电泳
• 3.6.3.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）所需试剂的配制
• 3.6.3.2 制备PAGE电泳步骤
• 3.7 白僵菌孢外毒蛋白的提取、纯化及其分子量、等电点、氨基酸序列测定
• 3.7.1 材料及主要试剂的配制
• 3.7.2 方法
• 3.7.2.1 接种母液的制备
• 3.7.2.2 胞外全蛋白提取液的制备
• 3.7.2.3 全蛋白提取液中单一蛋白的分离纯化
• 3.7.2.4 筛选有杀虫活性的毒蛋白的生物测定
• 3.7.2.5 蛋白分子量的测定
• 3.7.2.6 蛋白等电点的测定
• 3.7.2.7 毒蛋白Bb36W-D的N-末端氨基酸序列分析
• 4 结果与分析
• 4.1 人工饲养松墨天牛生活史及习性
• 4.2 松墨天牛微粒子虫形态观察
• 4.3 微粒子虫感染松墨天牛野外流行调查
• 4.4 对松墨天牛高毒力的白僵菌菌株的筛选
• 4.4.1 不同白僵菌菌株初步生测结果
• 4.4.2 白僵菌菌株Bb6和Bb8的生测结果
• 4.5 白僵菌菌株Bb6感染松墨天牛后体内酯酶同工酶变化
• 4.6 白僵菌孢外毒蛋白的提取、纯化及其分子量、等电点、氨基酸序列测定
• 4.6.1 提取出的孢外毒蛋白的种类及生测结果
• 4.6.2 Bb36W-D分子量的测定
• 4.6.3 等电点的测定
• 4.6.4 N-末端氨基酸序列分析
• 5 结论与讨论
• 5.1 结论
• 5.2 讨论
• 参考文献
• 英文摘要
• 附图