论文摘要
目的:已有大量研究显示,Wnt家族成员Wnt5a与许多实体肿瘤的发生、发展密切相关,但其与白血病发生的关系,以及作用机制迄今不明。我们前期的研究发现,Wnt5a在髓系和淋巴系白血病病例、白血病细胞株中表达降低或缺失,但在治疗缓解的病例中显示Wnt5a表达恢复。并且在白血病细胞株K562、HL-60和U937中发现Wnt5a基因启动子甲基化,在多发性骨髓瘤、髓系和淋巴系白血病病例中,同样也存在甲基化的现象,但正常人和已经缓解的病例中却没有发现甲基化。此外,外源性Wnt5a可诱导K562细胞发生分化,并观察到个别向单核细胞分化的现象。以上均提示,Wnt5a表达缺失或降低可能是白血病发生的机制之一。本研究旨在前期研究的基础上,以本实验室已成功构建的稳定过表达Wnt5a的K562细胞株（K562-Wnt5a）和对照细胞株（K562-vector）为模型,更加深入的探讨Wnt5a在K562细胞中发挥其作用的机制。结果表明Wnt5a介导不同受体组合,可激活非经典通路并抑制经典Wnt信号通路;亦可激活经典Wnt信号通路。由此我们认为,这种不同信号通路的相互转化,可能导致Wnt5a在白血病的发生中起不同作用,为今后有望以Wnt5a为靶点的的白血病分子靶向治疗和诊断提供理论依据。方法:1.在K562细胞中Wnt5a调控Ror2、Frz4、LRP5受体表达及定位的研究。1.1 Western blotting、免疫荧光染色、免疫细胞化学染色、激光共聚焦三维重构的方法,分别检测在K562细胞中,Wnt5a对Ror2、Frz4、LRP5受体的表达和定位的影响。1.2免疫荧光染色检测Ror2分别在293、HepG2、L02细胞中的表达定位,并对比分析。1.3免疫电镜检测,在K562细胞中Wnt5a是否诱导Ror2受体内吞。2.在K562细胞中Wnt5a通过不同受体途径激活经典或非经典Wnt信号通路的研究。2.1在K562细胞中,Wnt5a通过Ror2/Frz4受体途径激活非经典通路,并抑制经典Wnt信号通路的检测及分析。2.1.1 Western blotting、免疫共沉淀的方法,检测Wnt5a是否通过Ror2/Frz4复合受体发挥作用。2.1.2 Western blotting、免疫荧光染色分别检测,β-catenin在K562细胞的总细胞、细胞核和细胞浆中的表达水平,及其在细胞内分布定位的情况。2.1.3 Western blotting、双荧光素酶报告基因,检测β-catenin磷酸化水平及β-catenin/TCF转录活性的变化,以及对下游靶基因cyclinD1表达的影响。2.2在K562细胞中,Wnt5a通过Frz4/LRP5受体途径,激活经典Wnt信号通路的检测及分析。2.2.1运用Ror2特异性抗体孵育K562细胞,以达到阻断非经典Wnt5a/Ror2/Frz4通路转导的目的。2.2.2 Western blotting、免疫共沉淀的方法,验证非经典Wnt5a/Ror2/Frz4信号通路的转导是否被阻断。2.2.3 Western blotting、免疫共沉淀检测,阻断非经典Wnt5a/Ror2/Frz4通路后,Wnt5a是否通过Frz4/LRP5复合受体发挥作用。2.2.4 Western blotting分别检测,阻断非经典Wnt5a/Ror2/Frz4通路后,β-catenin,磷酸化β-catenin,以及cyclinD1表达水平的变化。2.2.5阻断非经典Wnt5a/Ror2/Frz4通路后,细胞增殖试验、流式细胞术,分别检测K562细胞增殖及细胞周期的变化。结果:1.过表达Wnt5a导致Ror2、Frz4受体表达显著高于对照细胞,LRP5表达无明显变化。此外,发现Ror2受体聚集表达于细胞核凹陷的胞浆区域,而Frz4、LRP5受体则主要定位于细胞膜及细胞浆中。2.免疫电子显微镜进一步检测,在细胞超微结构下显示,Wnt5a-K562细胞中具有Ror2免疫原性的颗粒物质（表现为电子密度显著增高）通过细胞膜内陷进入细胞浆,并最终定位于细胞核凹陷处的胞浆区域。3.与对照细胞相比,在Wnt5a-K562细胞中,显示Wnt5a与Ror2共表达、且相互作用增强。此外,Ror2与Frz4受体的结合亦增强。推断Wnt5a可能通过Ror2/Frz4复合受体发挥作用。4.Wnt5a没有影响β-catenin在总细胞和细胞浆中的表达水平,但改变了其在细胞核中的分布,即减少了β-catenin入核。5.Wnt5a过表达导致β-catenin出现磷酸化,使β-catenin/TCF的转录活性显著降低,最终导致下游靶基因cyclinD1表达下调。推测Wnt5a通过Ror2/Frz4受体途径激活非经典通路,并抑制经典Wnt信号通路。6.Ror2抗体通过与细胞中Ror2受体的特异性结合,阻断了非经典Wnt5a/Ror2/Frz4信号通路的转导。显示Wnt5a诱导Frz4高表达,且Frz4与LRP5受体相互作用增强,推断在Ror2受体表达减少或缺失时,Wnt5a即通过Frz4/LRP5复合受体发挥作用。7.阻断非经典Wnt5a/Ror2/Frz4信号通路后,发现β-catenin、cyclinD1均表达上调,并且β-catenin未出现磷酸化。推断此时在K562细胞中,Wnt5a介导Frz4/LRP5受体途径激活了经典Wnt信号通路。8.激活了经典Wnt5a/Frz4/LRP5信号通路,使K562细胞的G1期下降,S期增高,变化明显,表明细胞处于增殖旺盛的状态,促进了细胞增殖,与细胞增殖试验的结果一致。结论:1.在K562细胞中,过表达Wnt5a诱导Ror2和Frz4受体表达增高,并在Frz4的协同下,介导Ror2受体内吞,激活非经典通路并抑制经典Wnt信号通路:从而抑制了β-catenin的核转移,促进其磷酸化,使β-catenin/TCF转录活性降低,下调下游靶基因cyclinD1的表达。此时Wnt5a可能起抑癌因子的作用。2.在K562细胞中,当Ror2表达减少或缺失时,Wnt5a介导Frz4/LRP5受体途径激活经典Wnt信号通路,上调β-catenin及cyclinD1的表达,并促进K562细胞增殖。其中Frz4分别与Ror2或LRP5受体结合成为不同的复合受体,协同Wnt5a转导经典或非经典Wnt信号通路。由此可见Frz4受体在此过程中起重要的枢纽作用。3.Wnt5a发挥抑癌基因或是癌基因的作用可能与细胞的种类,即细胞表面所表达的受体有关。由于Wnt5a可通过不同的受体激活不同的信号通路,转导活化不同的下游靶基因表达,从而产生不同的调节作用。由此可见,Wnt5a在白血病中发挥的作用也与其相关分子的复杂性密切相关。