菜青虫N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的性质研究

论文摘要

比较菜青虫不同部位及不同生长期的菜青虫N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAGase,EC3.2.1.52）的比活力,发现五龄幼虫表皮来源的NAGase比活力最高。通过解剖获得五龄菜青虫表皮,用0.05 mol/L PBS含0.1 mol/L NaCl缓冲液（pH=6.8）抽提、硫酸铵分级分离获得粗酶,并进一步通过Sephadex G-200凝胶过滤柱层析和羟基磷灰石柱层析（CHT II柱）纯化获得比活力为8715 U/mg的聚丙烯酰胺凝胶电泳单一纯NAGase酶制剂。采用凝胶过滤柱层析法测定该酶的分子量约为106 kD。通过SDS- PAGE方法测定NAGase含两个异型亚基,分子量分别为59.5和57.2 kD。该酶不含寡糖。以对-硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷（pNP-NAG）为底物,测得该酶在0.1 mol/L PBS缓冲液中催化水解底物pNP-NAG的最适pH为6.2,最适温度为42℃;在37℃、pH 6.2 PBS中,该酶催化pNP-NAG水解的米氏常数Km为0.326 mmol/L,反应的活化能为83.86 KJ/mol。该酶在45℃以下,pH 4-9范围内稳定。以动力学方法测定酶活性功能基团的解离性质,39℃下测得菜青虫NAGase酶活性中心可解离基团解离常数pKe值为5.20,标准解离热焓ΔHo为2.18 kcal/mol,表明该酶的活性中心的可解离基团是谷氨酸或天冬氨酸的侧链羧基。化学修饰法研究进一步证明侧链羧基是酶的必需基团,并测定出酶活性必需的羧基数为一个。修饰剂对该酶的化学修饰研究还表明半胱氨酸巯基、色氨酸的吲哚基、组氨酸的咪唑基、二硫键也是酶活性的必需基团。而精氨酸残基及赖氨酸ε-氨基被修饰后对酶活力没有影响,不是酶的必需基团。通过对产物NAG与产物pNP的类似物苯酚对酶的抑制作用研究表明酶催化底物pNP-NAG水解反应属有序双双机理。通过对变性剂盐酸胍和脲的作用下菜青虫NAGase活力和构象变化的比较表明酶的活力变化快于构象变化。说明该酶分子的活性中心处于对变性剂较敏感的区域,即活性部位具有柔曲性。比较酶经热失活后活力与构象变化间的关系,也得到酶活力丧失明显快于其构象的结果。通过失活动力学方法测定热失活速度常数得到自由酶的热失活速度常数（k+0）明显大于酶-底物络合物的失活速度常数(k+0’),说明底物与酶的结合对酶的热失活作用有一定的保护作用。

论文目录

• 摘要
• Abstracts
• 第一章 前言
• 1.1 几丁质水解酶的研究概况
• 1.2 几丁质水解酶抑制剂的研究
• 1.3 昆虫几丁质水解酶及其抑制剂在植物保护中的应用
• 1.4 几丁质水解酶在其它方面的应用
• 1.5 菜青虫的概况
• 1.6 本课题的研究内容与研究意义
• 第二章 实验材料、仪器与方法
• 2.1 材料与试剂
• 2.2 仪器
• 2.3 方法
• 第三章 实验结果
• 3.1 菜青虫不同部位来源NAGASE及不同龄期菜青虫NAGASE比活力的比较
• 3.2 菜青虫表皮NAGASE的分离纯化与纯度鉴定
• 3.3 NAGASE的理化特征
• 3.4 NAGASE催化反应的动力学性质研究
• 3.5 酶活性部位解离基团性质的研究
• 3.6 酶活性必需基团的研究
• 3.7 酶的催化机理研究
• 3.8 酶在盐酸胍和脲变性作用下的失活与去折叠
• 3.9 酶的热失活动力学
• 3.10 金属离子对NAGASE的影响
• 3.11 有机溶剂对酶活力的影响
• 3.12 效应物对酶活力的影响
• 第四章 讨论
• 4.1 菜青虫表皮NAGASE分离纯化与酶学性质
• 4.2 酶活性部位功能基团的研究
• 4.3 酶催化机理的研究
• 4.4 酶在盐酸胍和脲变性作用下的失活与去折叠研究
• 4.5 酶在热变性过程中构象与活力变化的研究
• 4.6 金属离子对NAGASE的影响
• 4.7 有机溶剂对酶活力的影响
• 4.8 效应物对酶活力的影响
• 4.9 植物提取物对NAGASE的影响
• 结论
• 参考文献
• 博士研究生期间发表的学术论文
• 已发表论文:
• 已接受待发表论文
• 致谢