肠三叶因子受体的分离、鉴定及其生物信息学分析

论文摘要

背景:肠三叶因子（intestinal trefoil factor , ITF或TFF3）是含有59个氨基酸残基的单链多肽[1],分子量为6.7kD,分子中含有1个三叶结构,其核心的3839个氨基酸残基中包含6个半胱氨酸,形成3对链内二硫键,两两相接产生特征性三叶结构,并因此而得名。研究表明,ITF是具有潜在药用价值的小分子多肽,能减轻各种致伤因素导致的粘膜损伤,促进肠上皮细胞增殖、移行,从而启动受损肠粘膜修复,促进粘膜屏障重建[2-4]。但ITF作用机制迄今尚不清楚,虽然观察到ITF与多条信号通路有关,但都不能完整地描绘出其作用信号网络。一些学者推测ITF可能通过自身受体（ITF receptor,ITFR）来传导信号,介导细胞的增殖和移行。本课题组前期进行了ITF受体配体放射性结合分析、动力学研究,明确ITF受体与配体结合相关参数及受体密度等数据,提出肠上皮细胞膜上存在特异ITF受体（ITFR）的观点。但ITFR是已知还是未知蛋白,其理化性质和功能均不清楚。目的:通过重组表达含有生物标签的hITF融合蛋白,利用pull-down技术钓取ITFR,并采用质谱分析、生物信息学分析及酵母双杂交等方法对获取的蛋白进行综合分析,以确定该蛋白是否为ITFR。方法:1.制备用于受体研究的重组hITF融合蛋白（1） hITF在毕赤母酵母菌中的表达和纯化:采用本课题组保存的酵母菌X-33（含pGAPZаA-hITF）,组成性表达hITF,表达上清经硫酸铵分级沉淀,Ni+-NTA亲和层析,超滤纯化三步法进行纯化浓缩,纯化后产物Western blot鉴定。（2） hITF融合蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化:通过PCR获取ITF成熟肽cDNA基因片段,克隆至质粒pGEX-4T-1获得重组载体;双酶切鉴定后转化至E.coliBL21 （DE3）进行诱导表达,优化表达条件获得最大表达产量;GST琼脂糖凝胶亲和层析、超滤离心纯化重组蛋白。SDS-PAGE蛋白电泳、Western blot和质谱鉴定ITF重组蛋白。2. ITFR的分离与生物信息学分析:以重组表达的带有生物标签的hITF蛋白为诱饵,将其固化到亲和层析凝胶上,与肠上皮细胞膜蛋白作用,利用受体配体间的相互作用,钓取受体蛋白,缓冲液洗脱,SDS-PAGE凝胶电泳分离,切胶酶解,质谱分析捕获的蛋白,并以免疫共沉淀予以验证。利用生物信息学软件和文献检索软件,分析所获取蛋白的一般理化性质、可能的跨膜区域、总疏水性、蛋白质GO注释,并以肠道、ITF及受体为关键词进行文献检索,将所获得的数据进行综合分析。3.酵母双杂交验证ITF相互作用蛋白:分别构建诱饵质粒和人结肠癌细胞HT-29cDNA文库,提取质粒,共转化至酵母菌Mav203;营养缺陷型培养基筛选阳性克隆,鉴定阳性克隆后测序;应用NCBI网站的BLAST工具对测序结果进行序列比对,分析是何种蛋白的基因序列。结果:1. hITF表达成功,获得纯度较高的重组hITF蛋白。（1）hITF在酵母菌X-33中组成性表达成功,表达产量约为50mg/L,经硫酸铵分级沉淀、Ni+-NTA亲和层析、超滤离心后获得纯度95%以上的重组hITF蛋白。（2）获得正确的hITF成熟肽cDNA序列,成功构建含目的基因的重组载体pGEX-4T-1-hITF;在大肠杆菌E.coli BL21（DE3）中进行表达,表达产物主要集中在细菌胞质中。重组hITF融合蛋白产量约120mg/L。Western blot和质谱分析证明重组蛋白具有良好的抗原性和特异性且蛋白序列正确;通过GST琼脂糖凝胶亲和层析、超滤离心后重组蛋白的纯度达95%以上。2.以含His标签的重组hITF融合蛋白为诱饵,利用pull-down技术获得了一个分子量约为35kD的特异性条带,以含有GST标签的重组hITF融合蛋白为诱饵蛋白的pull-down实验和免疫共沉淀实验同样证实该35kD蛋白的存在。对质谱分析所获得95个候选蛋白利用生物信息学手段分析蛋白的分子量、等电点、不稳定系数、疏水性、蛋白分布、跨膜域预测和GO注释,依据分子量大小、蛋白质分布和可能的跨膜域GO注释结果得到3个ITFR候选蛋白:PDZD2、Wnt8b、ITIH4,文献检索其与肠道、ITF及受体相关的文章分别为15篇、17篇、23篇。3.成功构建诱饵质粒和人结肠癌细胞HT-29cDNA文库,质粒共转化至酵母菌Mav203,筛选阳性克隆进行鉴定并测序,比对分析后共筛选出4个ITF相互作用蛋白:PDZD2、TIMP1、CD44 antigen和VPS4-1。结论:1.制备了用于ITF受体研究的重组hITF融合蛋白。2.使用pull-down技术获得了一个分子量约为35kD的特异性条带并做质谱分析,对质谱数据进行生物信息学分析,初步判定PDZD2、Wnt8b、ITIH4为ITFR候选蛋白。3.酵母双杂交获取4个ITF相互作用蛋白PDZD2、TIMP1、CD44 antigen和VPS4-1。4.综合各分析结果,认为PDZD2与ITFR的关系最密切,ITFR很可能是具有PDZ结构域或类似PDZ结构域的一种新蛋白。

论文目录

• 英文缩写词表
• 英文摘要
• 中文摘要
• 论文正文 肠三叶因子受体的分离、鉴定及其生物信息学分析
• 前言
• 第一部分 制备用于受体研究的肠三叶因子
• 实验一 hITF 在毕赤酵母菌中的表达及纯化
• 一、实验材料
• 二、实验方法
• 三、实验结果
• 实验二 hITF 在大肠杆菌中的表达和纯化
• 一、实验材料
• 二、实验方法
• 三、实验结果
• 讨论
• 结论
• 第二部分 肠三叶因子受体的获取
• 材料和方法
• 一、实验材料
• 二、实验方法
• 三、实验结果
• 讨论
• 结论
• 第三部分 酵母双杂交验证ITF相互作用蛋白
• 材料和方法
• 一、实验材料
• 二、实验方法
• 三、实验结果
• 讨论
• 结论
• 全文总结
• 致谢
• 参考文献
• 文献综述三叶肽家族相互作用蛋白研究进展
• 参考文献