论文摘要
获取高分辨率的小鼠全脑神经元连接图谱对认识脑的信息处理机制、疾病致病机理和发育异常等具有重要意义。神经系统中表达荧光蛋白的小鼠模型是研究脑的结构和功能连接网络的有力工具，但现有的成像技术尚无法在大范围内获取荧光蛋白标记神经元的精细连接关系。近年发展起来的基于塑性包埋和超薄切片的显微光学层析成像技术，典型代表如可实现亚微米分辨的显微光学切片断层成像系统，被认为是目前最有效的对大体积样本进行微米甚至更高水平的精细结构三维成像的方法之一。然而，这类技术还难以应用于荧光蛋白标记的大样本（比如完整的小鼠脑），最主要的原因是缺少可行的样本制备方法。因此，本文旨在发展一种能适用于荧光蛋白标记大样本的塑性包埋方法，并将其应用于小鼠全脑的精细连接结构研究。针对树脂包埋的荧光保持率进行了定量测试和优化。本文提出了基于100μm厚的小鼠脑片和双光子显微镜的荧光变化测量方法。定量研究了黄色荧光蛋白（YellowFluorescent Protein, YFP）经六种树脂分别包埋后的荧光强度变化，发现这些树脂的荧光保持率从大到小依次为HPMA、Technovit8100、JB-4、GMA、Unicryl和LR White。在此基础上，优化了GMA的配方和使用方法，并首次使得YFP在GMA树脂包埋后的荧光保持率提高了近一倍。针对水环境下树脂的切片性能进行了研究。以显微光学切片断层成像系统为实验平台，建立了评估树脂在水环境下的切片性能的研究方法，并用于多种树脂固化块的水中1μm切片性能研究，研究发现HPMA、GMA、Unicryl、LR White等树脂可在长时间水浸泡条件下进行连续稳定的1μm切片。针对大样本中树脂的渗透性能进行了研究。以小鼠全脑作为生物大样本，建立了测试树脂在大样本中的渗透速度的研究方法，并用于评估不同树脂的渗透速度，研究发现LR White、Unicryl、GMA在合适的条件下23天内可充分渗透小鼠全脑，而HPMA渗透小鼠全脑需要2周以上的时间。基于前述研究结果，建立了一套完整的适用于荧光蛋白标记小鼠全脑的GMA树脂包埋方法。利用该方法制备的Thy1-eYFP-H小鼠全脑样品能够在可实现荧光成像的显微光学切片断层成像系统中进行连续稳定的1μm厚度切片，同时实时采集YFP荧光图像，最终可获得体素1μm分辨率的小鼠全脑数据集。通过对该数据集进行图像预处理和三维重建，可显示荧光蛋白标记的神经元在小鼠全脑三维空间中的长程投射路径。随着转基因小鼠模型资源的不断丰富，本文发展的塑性包埋方法有潜力在获取哺乳动物神经网络甚至是血管网络中发挥重要作用。本文建立的塑性包埋方法还可以推广应用到多色荧光蛋白标记组织以及其它动物器官等等的样品制备和高分辨率结构数据获取中。