胰脂酶相关蛋白的条件性表达机制及其在肝纤维化基因治疗的研究

论文摘要

肝硬化是目前威胁人类健康的最重要疾病之一,发病率居高不下,而且随着各种因素的影响其发病率依然呈上升趋势。肝纤维化是多数慢性肝病发展的共同病理过程,其发病机理不十分清楚,也缺少有效的治疗方法。大量的研究表明肝星状细胞（Hepatic stellate cell, HSC）的激活在肝纤维化形成过程中起关键性的作用,抑制肝脏的维生素A酯水解能有效的抑制HSC的激活被认为是治疗肝纤维化的靶点。目前还没有确定在生理状态下肝脏维生素A酯水解的酶系。胰脂酶基因胰脂肪酶相关蛋白2 （murine Pancreatic lipase-related protein 2, mPlrp2）和胰辅酯酶（murine Procolipase, mClps）被发现可以通过环境光诱导在肝脏条件性表达。在此基础上本研究较为系统地研究了光信号调控的mPlrp2和mClps的条件性表达的分子机制,并证实了它们在肝维生素A代谢和肝纤维化进程中的作用。本研究首先分析了不同光照条件下小鼠血清中维生素A及其衍生物含量的变化。高效液相色谱（High-performance liquid chromatography, HPLC）结果显示在缺乏光照48小时后小鼠血清中全反式视黄酸（all-trans Retinoic acid, ATRA）的含量由2.45 ng/mL下降到1.75 ng/mL,肝中mPlrp2和mClps启动表达。缺乏光照小鼠曝光4小时后血清中ATRA含量又升高到2.43 ng/mL,肝中mPlrp2和mClps的表达被抑制。这表明ATRA是光信号调控周围器官基因表达的上游信号分子。Northern Blot和HPLC分析显示ATRA能通过视黄酸核受体调控胞外-5-核苷酸酶（Ecto-5’-Nucleotidase, Cd73）的表达,并调节血清中腺苷-5’-单磷酸（Adenosine-5’-Monophosphate,5’-AMP）的量。提升5’-AMP的含量能激活肝中mPlrp2、mClps的表达。这证明ATRA是通过Cd73调节5’-AMP的含量调控肝中mPlrp2、mClps的表达。肝脏中mPlrp2、mClps被激活后,肝酯和血酯含量明显下降,表明这两个基因参与了肝脂代谢。这些数据确定了光信号传导并调控肝脏脂肪代谢基因mPlrp2、mClps表达途径中的两个重要分子ATRA和5’-AMP,并由此提出环境光与周围器官发生交流的分子信号模型。为了确定mPlrp2和mClps在肝脏脂肪代谢,尤其是在肝维生素A酯代谢中可能的作用,实验通过喂养维生素A缺乏食物复制了维生素A缺乏动物模型。聚合酶链式反应（Real Time-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR）分析显示在喂养维生素A缺乏食物7天后导致小鼠肝脏中脂肪代谢基因mPlrp2和mClps启动表达。定量实时PCR （Quantitative Real-time PCR, QRT-PCR）和HPLC分析显示给维生素A缺乏小鼠注射甲硫腺苷能明显抑制mPlrp2和mClps的表达,导致血液中维生素A的含量由0.59μg/mL下降到0.39μg/mL。这说明mPlrp2和mClps参与了肝脏维生素A酯的分解和利用。HPCL分析不同组织间核苷酸含量时发现脂肪水解酶mPlrp2和mClps在维生素A缺乏小鼠肝中启动表达与S-腺苷-L-蛋氨酸（S-adenosyl-L-methionine, AdoMet）和S-腺苷高半胱氨酸S-adenosylhomocysteine, AdoHcy的比例有关。维生素A缺乏、缺少光照或者注射5’-AMP能提高AdoMet和AdoHcy的比例,诱导mPlrp2和mClps在肝脏中表达,而注射ATRA能降低AdoMet和AdoHcy的比例,从而抑制这两个基因在肝中的表达。染色体免疫沉淀分析发现给小鼠喂以维生素A缺乏的食物能提高mPlrp2和mClps的启动子区域组蛋白（Histone3 Lysine 4, H3K4） H3K4甲基化水平,从而激活肝脏中mPlrp2和mClps的表达。这说明mPlrp2和mClps的表达与启动子区域组蛋白甲基化水平调控。肝脏维生素A酯绝大部分储存在HSC中。RT-PCR分析了HSC-T6、HepG2、H22、Melanoma等细胞系中mPlrp2和mClps的表达情况,发现只有在激活的肝星状细胞系HSC-T6中这两个基因启动表达。利用小片段干扰RNA （Small interfering RNA, siRNA）干扰HSC-T6细胞中mClps的翻译能明显减少细胞中维生素A酯的水解。这进一步说明mPlrp2和mClps参与了肝脏维生素A酯的分解和利用。这些动物和细胞实验证明mClps、mPlrp2参与了肝脏中维生素A酯的水解,完善了体内维生素A体内代谢途径,初步解决了长期困惑人们的肝脏中维生素A酯如何分解和利用的生物化学问题。肝脏在形成纤维化时首先表现出星状细胞激活,并丢失细胞中储存的维生素A酯（Retinyl Ester, RE）。抑制肝脏的维生素A酯水解能有效的抑制HSC的激活被认为是治疗肝纤维化的靶点。这里分别采用注射四氯化碳和胆管结扎复制了小鼠肝纤维化模型。纤维化小鼠肝中mClps、mPlrp2启动表达,并且这两个基因的表达与星状细胞激活的标记α-SMA的表达呈线性相关。通过RNA干扰技术（RNA interference, RNAi）干扰肝中mPlrp2的翻译能减少肝星状细波胞的激活,改善肝纤维化。用于治疗肝纤维化的药物S-腺苷蛋氨酸同样能抑制肝中mClps、mPlrp2的表达。这些数据表明抑制肝脏脂肪代谢基因mClps、mPlrp2的表达对肝纤维化具有保护作用,mPlrp2和mClps有潜力成为肝纤维化的基因治疗的新的药物靶点。

论文目录

摘要

Abstract

注释表

1 绪论

1.1 环境光对哺乳动物的生理和行为的影响

1.1.1 环境光对哺乳动物昼夜节律和睡眠的影响

1.1.2 环境光对大脑功能的影响

1.1.3 环境光对动物基因表达的影响

1.1.4 总结

1.2 维生素A在动物体内的吸收、代谢和功能

1.2.1 维生素A的体内吸收

1.2.2 肝脏中维生素A的吸收

1.2.3 血液中维生素A的运输

1.2.4 胞内视黄醛和视黄酸的形成

1.2.5 维生素A作用机理

1.3 脂肪代谢基因mClps

1.3.1 脂肪代谢基因mClps表达的器官特异性

1.3.2 脂肪代谢基因mClps对环境光的反应

1.4 肝纤维化的研究进展

1.4.1 肝细胞机制

1.4.2 参与肝纤维化的细胞因子

1.5 S-腺苷甲硫氨酸在肝脏修复和损伤中的作用

1.5.1 SAMe的合成和降解

1.5.2 SAMe在肝脏损伤中的作用

1.5.3 SAMe能调节肝实质细胞的生长

1.5.4 SAMe对肝实质细胞凋亡的调控

1.5.5 SAMe对肝脏疾病的治疗作用

1.5.6 MTA在SAMe作用机理中的作用

1.6 维生素A的代谢和肝脏纤维化

1.6.1 肝纤维化形成过程中体内类视黄醇的变化

1.6.2 视黄酸对肝纤维化形成影响

1.6.3 CRBP1与肝纤维化

1.6.4 LRAT与肝纤维化

1.7 肝纤维化过程中的RNA特异性干扰

1.7.1 水动力转染

1.7.2 局部注射

1.8 本课题提出的意义和主要研究方向

1.9 参考文献

2 环境光通过影响血液中全反式视黄酸含量调控肝脏mPlrp2、mClps表达和肝内脂肪代谢

2.1 实验材料

2.1.1 实验仪器

2.1.2 实验动物

2.1.3 实验试剂

2.2 实验方法

2.2.1 血清中ATRA含量的测定

2.2.2 血清中视黄醇含量分析

2.2.3 肝脏中ATRA含量分析

2.2.4 肝脏中ATR含量分析

2.2.5 肝脏中维生素A酯含量分析

2.2.6 基因表达分析

2.2.7 SDS PAGE蛋白电泳

2.2.8 Western Blot

2.2.9 血清中腺苷-5'-单磷酸含量的测定

2.2.10 血清中甘油三酯、胆固醇含量的测定

2.2.11 肝组织切片的制作和染色

2.2.12 RNA印迹（Northern Blot）

2.3 实验设计

2.3.1 不同光照条件下血清中ATRA含量的分析

2.3.2 环境光对肝脏脂肪代谢基因表达影响的分析

2.3.3 ATRA对小鼠肝脏中mClps、mPlrp2表达影响的分析

2.3.4 ATRA对血清中5'-AMP含量影响

2.3.5 腺苷受体对肝脏中mClps和mPlrp2表达的影响

2.3.6 LD和DD条件下小鼠体内维生素A含量变化的分析

2.3.7 LD和DD条件下小鼠体内脂肪代谢变化的分析

2.3.8 持续黑暗对小鼠肝内脂肪代谢的变化

2.4 实验结果

2.4.1 不同光照条件下血清中ATRA含量的变化

2.4.2 环境光对肝脏脂肪代谢基因表达的影响

2.4.3 ATRA对小鼠肝脏中mClps、mPlrp2表达影响的分析

2.4.4 ATRA对胞外-5'核苷酸酶的表达和血清中5'-AMP含量影响

2.4.5 腺苷受体对肝脏中mClps和mPlrp2表达的影响

2.4.6 LD和DD条件下小鼠体内维生素A含量变化的分析

2.4.7 LD和DD条件下小鼠体内脂肪代谢变化

2.4.8 持续黑暗对小鼠肝内脂肪代谢的影响

2.5 结果讨论

2.6 参考文献

3 mClps、mPlrp2参与肝脏中维生素A酯水解

3.1 实验材料

3.1.1 实验仪器

3.1.2 实验动物

3.1.3 实验试剂

3.2 实验方法

3.2.1 肝星状细胞系HSC-T6细胞中RE含量分析

3.2.2 血清中ATR含量分析

3.2.3 基因表达分析

3.2.4 HSC-T6细胞转染方案

3.3 实验设计

3.3.1 光波长和光照强度对肝脏中mPlrp2和mClps表达的影响

3.3.2 喂饲VA-free食物对肝中mPlrp2和mClps表达的影响

3.3.3 5'-甲硫腺苷对肝中mPlrp2和mClps的表达和血清中视黄醇含量的影响

3.3.4 肝星状细胞HSC-T6中mPlrp2和mClps的表达情况

3.3.5 5'-甲硫腺苷对HSC-T6中维生素A酯水解的影响

3.3.6 SiRNA-Plrp2对HSC-T6中维生素A酯水解的影响

3.4 实验结果

3.4.1 弱光照激活肝脏中mPlrp2和mClps的表达

3.4.2 喂饲VA-free食物激活肝中mPlrp2和mClps的表达

3.4.3 甲硫腺苷抑制肝中mPlrp2和mClps的表达,并明显降低血清中视黄醇含量

3.4.4 肝星状细胞HSC-T6特异性表达mPlrp2和mClps

3.4.5 5’-甲硫腺苷抑制HSC-T6中维生素A酯的水解

3.4.6 SiRNA-Plrp2质粒的构建和结构

3.4.7 SiRNA-Plrp2抑制HSC-T6中维生素A酯的水解

3.5 结果讨论

3.6 参考文献

4 S-腺苷蛋氨酸和S-腺苷高半胱氨酸的比例调控mPlrp2和mClps组织特异性表达

4.1 实验材料

4.1.1 实验仪器

4.1.2 实验动物

4.1.3 实验试剂

4.2 实验方法

4.2.1 组织中AdoMet和AhoHcy含量的测定

4.2.2 组织中ATP、ADP、AMP含量的测定

4.2.3 染色体免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation,ChIP）

4.3 实验设计

4.3.1 胰腺中mPlrp2和mClps的特异性表达与S-腺苷蛋氨酸和S-腺苷高半胱氨酸比例的关系分析

4.3.2 光照对肝中S-腺苷蛋氨酸和S-腺苷高半胱氨酸的比例的影响

4.3.3 分别注射ATRA和5'-AMP对肝中S-腺苷蛋氨酸和S-腺苷高半胱氨酸的比例的影响

4.3.4 喂饲VA-free食物对小鼠肝脏中mPlrp2和mClps的启动子区域结合组蛋白H3K4三甲基化的影响

4.3.5 抑制甲基化酶活对肝脏和星状细胞中mPlrp2和mClps表达的影响

4.4 结果讨论

4.4.1 胰腺中mPlrp2和mClps的特异性表达与S-腺苷蛋氨酸和S-腺苷高半胱氨酸的比例有关

4.4.2 持续黑暗和弱光照提升肝中S-腺苷蛋氨酸和S-腺苷高半胱氨酸的比例

4.4.3 分别注射ATRA和5'-AMP改变肝中S-腺苷蛋氨酸和S-腺苷高半胱氨酸的比例

4.4.4 喂饲VA-free食物激活肝中肝中mPlrp2和mClps的表达与增加mPlrp2和mClps的启动子区域结合组蛋白H3K4三甲基化有关

4.4.5 甲基化酶抑制剂抑制mPlrp2和mClps的表达

4.5 结果讨论

4.6 参考文献

5 S-腺苷蛋氨酸和SiRNA抑制肝脏mClps、mPlrp2的表达并改善肝纤维化

5.1 实验材料

5.1.1 实验仪器

5.1.2 实验动物

5.1.3 实验试剂

5.2 实验方法

5.2.1 血清中ATR含量分析

5.2.2 免疫组化实验方案

5.2.3 基因表达分析

5.2.4 Masson's trichrome染色

5.3 实验设计

5.3.1 肝纤维化对肝脏mPlrp2和mClps的表达的影响

5.3.2 mPlrp2和mClps的表达与肝星状细胞的激活的关系

5.3.3 SiRNAplrp2对BDL导致的肝纤维化的治疗作用

5.3.4 SAM对肝内mPlrp2和mClps表达和体内、外维生素A酯水解的影响

5.3.5 BDL小鼠肝内mPlrp2启动子区域结合组蛋白H3K4三甲基化增加诱导mPlrp2表达

5.4 实验结果

5.4.1 肝纤维化激活肝脏mPlrp2和mClps的表达

5.4.2 mPlrp2和mClps的表达随着星状细胞的激活而升高

5.4.3 ShRNAplrp2改善BDL导致的肝纤维化

5.4.4 SAM抑制肝内mPlrp2表达并减少体内、外维生素A酯水解

5.4.5 BDL小鼠肝内mPlrp2启动子区域结合组蛋白H3K4三甲基化增加诱导mPlrp2表达

5.5 结果讨论

5.6 参考文献

全文总结

论文创新点

致谢

附录攻读博士学位期间发表的论文和出版著作情况

胰脂酶相关蛋白的条件性表达机制及其在肝纤维化基因治疗的研究

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