茶树内生枯草芽孢杆菌的研究

论文摘要

最终从茶树体内分离、筛选获得14株能对四种茶叶斑病菌拮抗作用强的芽孢杆菌菌株。经进一步鉴定，菌株TL2为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。 14个目标菌株都具有能在茶树体内内生定殖、对茶叶斑病菌及其它植物病原菌有一定的拮抗能力、对茶轮斑病有防病效果、对氯氰菊酯有一定的降解能力，但对茶苗的促生效果不明显。其中，菌株TL2具有较强的内生定殖能力、拮抗能力强且拮抗谱广、对茶轮斑病防病效果强、对氯氰菊酯的降解作用强。 茶苗接种菌株TL2后，可以先后从根尖、主根、茎基、茎部、下部叶片，乃至上部叶片等组织内分离到细菌。菌体主要分布在根部厚壁组织的细胞间隙，茎部厚角组织的细胞间隙以及中主鞘、木质部和韧皮部等组织的细胞间隙，以及叶片的气孔器附近、上、下表皮细胞间隙、厚角组织细胞间隙以及内皮层组织细胞间隙等。同时，茶苗体内所有内生细菌的种群数量随着时间逐渐减少，其多样性系数也随着时间有所降低。 菌株TL2能在茶树体内内生定殖，占据有利生态位点，改变茶树体内微生物的种群数量、多样性及其群体生物学功能等生态结构，从而抑制茶轮斑病菌的侵入和扩展。其次，菌株TL2可以通过分泌多种抗菌蛋白或其它活性物质，抑制或杀死茶轮斑病菌菌丝生长、分生孢子的形成和萌发，从而抑制茶轮斑病菌在茶树体内的扩展，降低病害的发生程度。再者，当茶轮斑病菌侵入茶树后，菌株TL2能通过诱导茶树相关抗病基因的表达，从而增强茶树体内活性氧相关酶如SOD、POD和CAT等的活性变化，以调节茶树体内活性氧的代谢平衡，减少茶树体内活性氧物质，降低膜脂过氧化程度；同时，菌株TL2能迅速增强非活性氧代谢的抗性酶系如PAL、β-1，3-葡聚糖酶和外切几丁质酶等的活性，使茶树体内生成相应的病程相关（PR）蛋白，作用于植物细胞壁，释放出寡聚糖作为激发寄主释放出主动防御反应的信号，以杀死病菌或限制病菌的扩展，从而使茶树的综合抗病能力得以提高。以上多种因子综合协同作用，是菌株TL2防治茶轮斑病的主要机制。 菌株TL2分泌蛋白的抗菌活性强、种类多。BSPT-P1是抑制茶轮斑病菌的一种主效蛋白，它可以通过病菌的代谢物来加强诱导。BSPT-P1大小为56KDa，抗菌活性高，对热稳定，耐紫外照射，在pH6.0～9.0之间稳定，被胰蛋白酶完全水解。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 植物内生细菌的研究概况
• 1.1 植物内生细菌的定义
• 1.2 植物内生细菌的种类
• 1.3 植物内生细菌的内生定殖
• 1.3.1 植物内生细菌的来源
• 1.3.2 植物内生细菌的侵入途径
• 1.3.3 内生细菌在植物体内的定殖动态
• 1.3.4 植物内生细菌定殖的检测方法
• 1.4 植物内生细菌的生物学功能
• 1.5 植物内生细菌的防病机制
• 1.5.1 分泌抗真菌或细菌的活性物质
• 1.5.2 增强植物的抗逆性
• 1.5.3 占据生态位与营养竞争
• 1.5.4 诱导植物系统抗性
• 2 茶树病害生物防治的研究现状
• 2.1 茶树病害的发生与危害
• 2.2 茶树病害防治存在的问题
• 2.3 茶树病害的生物防治
• 3 枯草芽孢杆菌的研究概况
• 3.1 枯草芽孢杆菌的概述
• 3.2 枯草芽孢杆菌的应用
• 3.3 枯草芽孢杆菌的抗菌蛋白
• 3.3.1 抗菌蛋白的种类
• 3.3.2 枯草芽孢杆菌的抗菌蛋白
• 第二章 茶树内生细菌的分离与筛选
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 样品来源
• 1.1.2 供试病原菌
• 1.1.3 培养基
• 1.1.4 标准（对照）菌株
• 1.1.5 染色剂和生理生化鉴定试剂
• 1.1.6 分子生物学试剂
• 1.2 茶树内生细菌的分离
• 1.3 拮抗菌株的筛选
• 1.4 目标菌株的鉴定
• 1.4.1 菌体的形态观察
• 1.4.2 生理生化测定
• 1.4.3 16S rRNA基因鉴定
• 2 结果与分析
• 2.1 茶树内生细菌的分离与筛选结果
• 2.1.1 茶树体内内生细菌的数量
• 2.1.2 茶树体内内生细菌的拮抗性筛选
• 2.2 目标菌株的鉴定结果
• 2.2.1 目标菌株的鉴定结果
• 2.2.2 菌株TL2的鉴定结果
• 3 小结与讨论
• 第三章 茶树内生细菌的生物学功能研究
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 培养基
• 1.1.2 供试农药
• 1.1.3 供试病原菌
• 1.1.4 供试茶苗
• 1.1.5 试剂与溶液
• 1.2 目标菌株的内生性测定
• 1.2.1 抗利福平突变菌株的筛选
• 1.2.2 接种与取样方法
• 1.2.3 内生细菌的分离与计数
• 1.3 目标菌株的拮抗性测定
• 1.3.1 对茶叶斑病菌的拮抗性测定
• 1.3.2 对其它植物病原真菌的拮抗性测定
• 1.3.3 对植物病原细菌的拮抗性测定
• 1.4 目标菌株的防病效果测定
• 1.5 目标菌株的促生效果测定
• 1.6 目标菌株的农药降解性测定
• 1.6.1 氯氰菊酯的标准曲线制作
• 1.6.2 氯氰菊酯的添加回收率测定
• 1.6.3 目标菌株对氯氰菊酯降解率的测定
• 1.7 目标菌株的抗逆性测定
• 2 结果与分析
• 2.1 目标菌株在茶树体内的定殖情况
• 2.2 目标菌株的拮抗谱
• 2.2.1 目标菌株对茶叶斑病菌的拮抗能力
• 2.2.2 目标菌株对其它植物病原菌的拮抗能力
• 2.3 目标菌株的室内盆栽防病效果
• 2.4 目标菌株对茶苗的促生作用
• 2.5 目标菌株对氯氰菊酯的降解率
• 2.6 目标菌株的抗逆性
• 3 小结与讨论
• 第四章 菌株TL2在茶树体内的内生机制研究
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 供试菌株
• 1.1.2 供试茶苗
• 1.1.3 培养基
• 1.1.4 质粒载体
• 1.1.5 试剂与溶液
• 1.2 抗生素标记法测定菌株TL2在茶树体内的定殖动态
• 1.2.1 利福平标记菌株的筛选
• 1.2.2 接种和取样方法
• 1.2.3 内生细菌的分离与计数
• 1.3 免疫显色法测定菌株TL2在茶树不同组织的分布动态
• 1.3.1 菌体抗血清的制备
• 1.3.2 接种和取样方法
• 1.3.3 切片观察
• 1.4 绿色荧光标记法测定菌株TL2在茶树组织内的分布动态
• 1.4.1 绿色荧光标记菌株的构建
• 1.4.2 接种和取样方法
• 1.4.3 切片观察
• 2 结果与分析
• 2.1 菌株TL2在茶树体内的种群变化动态
• 2.2 菌株TL2的免疫特异蛋白
• 2.3 菌株TL2在茶树组织内的分布动态
• 3 小结与讨论
• 第五章 菌株TL2对茶树轮斑病的防病机制研究
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 供试菌株
• 1.1.2 供试植物
• 1.1.3 培养基
• 1.1.4 试剂与溶液
• 1.2 菌株TL2对茶轮斑病菌的抑制测定
• 1.3 菌株TL2对茶轮斑病菌的抗菌活性物质测定
• 1.3.1 样品的制备
• 1.3.2 样品的抗菌活性测定
• 1.4 菌株TL2对茶树生理生化指标的影响测定
• 1.4.1 接种和取样方法
• 1.4.2 粗酶液的制备
• 1.4.3 粗酶液的活性测定
• 2 结果与分析
• 2.1 菌株TL2对茶轮斑病菌的影响
• 2.2 菌株TL2的抗菌活性物质
• 2.3 菌株TL2对茶树生理生化指标的影响
• 2.3.1 茶树体内可溶性蛋白含量的动态变化
• 2^-产生速率的动态变化'>2.3.2 茶树体内O₂^-产生速率的动态变化
• 2.3.3 茶树体内丙二醛含量的动态变化
• 2.2.4 茶树体内还原型抗坏血酸含量的动态变化
• 2.3.5 茶树体内超氧化歧化酶活力的动态变化
• 2.3.6 茶树体内过氧化物酶活力的动态变化
• 2.2.7 茶树体内过氧化氢酶活力的动态变化
• 2.2.8 茶树体内苯丙氨酸解氨酶活力的动态变化
• 2.2.9 茶树体内β-1，3-葡聚糖酶活力的动态变化
• 2.2.10 茶树体内外切几丁质酶活力的动态变化
• 3 讨论
• 第六章 菌株TL2抗菌蛋白的分离及其性质研究
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 供试菌株
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 试剂与溶液
• 1.2 硫酸铵分级沉淀法分离菌株TL2的抗菌蛋白
• 1.2.1 蛋白样品的制备
• 1.2.2 蛋白样品的抗菌活性测定
• 1.2.3 离子交换层析
• 1.2.4 不连续非变性凝胶电泳
• 1.2.5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 1.3 诱导差异显示法分离菌株TL2的抗菌蛋白
• 1.3.1 蛋白样品的制备
• 1.3.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 1.3.3 双向电泳
• 1.3.4 双向凝胶差异蛋白点的酶切制备
• 1.3.5 MALDI-TOF质谱分析
• 1.4 菌株TL2抗菌蛋白的性质研究
• 1.4.1 抗菌蛋白的纯化
• 1.4.2 蛋白样品的抗菌活性测定
• 1.4.3 抗菌蛋白的热稳定性测定
• 1.4.4 抗菌蛋白的抗紫外线活性测定
• 1.4.5 抗菌蛋白的pH稳定性测定
• 1.4.6 抗菌蛋白的蛋白酶稳定性测定
• 2 结果与分析
• 2.1 菌株TL2抗菌蛋白的硫酸铵分级沉淀法分离结果
• 2.2 菌株TL2抗菌蛋白的诱导差异显示法分离结果
• 2.3 菌株TL2抗菌蛋白的性质
• 3 小结与讨论
• 总结
• 参考文献
• 附录Ⅰ 英文缩略词
• 附录Ⅱ 培养基配方
• 附录Ⅲ 试剂与溶液的配制
• 附录Ⅳ 菌株TL2分泌蛋白的肽质量指纹图谱
• 附录Ⅴ 攻博期间发表（或投稿）论文
• 致谢