牛新孢子虫抗原分析及间接ELISA检测方法的建立

论文摘要

新孢子虫病（Neosporoasis）是由犬新孢子虫（Neospora caninum）寄生于犬、牛、马、羊等多种宿主动物细胞内而引起的一种原虫病。该病对牛的危害尤为严重,主要造成孕畜流产、死胎以及新生犊牛的运动神经系统疾病,给畜牧业生产造成了巨大的经济损失。本试验为研究牛新孢子虫的可溶性抗原特性,提取经纯培养的新孢子虫NC-1株虫体,将虫体经反复冻融、超声波裂解制备成粗提抗原,经过Sephadex G-200分离提纯后,应用十二烷基硫酸钠-聚炳烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）及免疫印迹（Western blot）对新孢子虫粗提及纯化抗原进行了分析。结果表明,牛新孢子虫可溶性抗原有四条蛋白带,其分子量分别为65kDa、55kDa、36kDa、29kDa,其中特异性抗原分子量为65kDa、36kDa、29kDa。为进一步完善牛新孢子虫的血清学诊断技术,本研究应用提纯特异性抗原建立了检测牛新孢子虫抗体的间接ELISA方法。结果表明,抗原浓度为6.25μg/mL、被检血清稀释度为1:100、酶标二抗稀释度为1:2 000为最佳工作浓度、底物显色时间为20min。该方法不与牛布氏杆菌、弓形虫等病阳性血清发生交叉反应,具有较好的特异性;该方法与IFAT平行检测144份牛血清样本,结果表明,比IFAT试验敏感性高7%,并且ELISA检测IFAT为阳性的符合率为100%。说明间接ELISA具有敏感、特异、稳定等优点,适用于牛新孢子虫抗体的检测。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 1 新孢子虫病原学研究进展
• 1.1 病原分类
• 1.2 形态结构
• 1.3 生活史
• 1.4 体外培养
• 1.5 新孢子虫主要抗原研究进展
• 2 牛新孢子虫病诊断方法
• 2.1 临床诊断
• 2.2 病原学诊断
• 2.3 血清学诊断
• 2.4 分子生物学诊断方法
• 3 牛新孢子虫病的危害
• 4 牛新孢子虫病防治研究
• 4.1 药物治疗
• 4.2 预防措施
• 5 本课题的研究目的及意义
• 材料与方法
• 1 材料
• 1.1 虫体培养所用材料
• 1.2 虫体收集、可溶性抗原提取及分离所用材料
• 1.3 SDS-PAGE及Western blot所用材料
• 1.4 ELISA所用材料
• 1.5 主要仪器
• 1.6 血清样品
• 2 方法
• 2.1 新孢子虫体外培养
• 2.2 新孢子虫可溶性抗原的提纯及分析
• 2.3 牛新孢子虫间接ELISA检测方法的建立
• 结果
• 1 新孢子虫的体外培养
• 2 新孢子虫抗原的提纯及分析
• 2.1 新孢子虫抗原的纯化
• 2.2 SDS-PAGE分析
• 2.3 免疫印迹分析
• 3 牛新孢子虫间接ELISA检测方法中反应参数的确定
• 3.1 抗原最佳包被浓度及包被时间的确定
• 3.2 血清最佳稀释度及工作时间的确定
• 3.3 酶标二抗最佳稀释度及工作时间的确定
• 3.4 底物最佳显色时间的确定
• 3.5 判定标准
• 3.6 特异性试验
• 3.7 重复性试验
• 3.8 间接ELISA与IFAT检测结果的比较
• 讨论
• 1 新孢子虫培养条件的优化
• 2 牛新孢子虫抗原的抗原性分析
• 3 ELISA方法检测牛新孢子虫抗体的探讨
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介