灰葡萄孢分泌系统sec5基因的克隆鉴定及其在致病性中的功能研究

论文摘要

灰葡萄孢（Botrytis cinerea）是一种可引起严重植物灰霉病的病原真菌,也是研究植物与微生物相互作用的重要模式生物之一。用遗传学的方法分析研究该真菌关键基因的功能,结合细胞学、生化方法将有利于我们对该病菌致病机制等的了解。本研究利用根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的T-DNA随机插入技术获得了致病力减弱的转化子ABcsec5,利用PCR扩增选择标记基因潮霉素抗性基因的办法对转化子进行了分子鉴定。利用Southern blot技术分析发现该转化子为T-DNA单拷贝插入。利用热不对称交错PCR（TAIL-PCR）技术扩增了该转化子的T-DNA插入位点旁侧序列,经过载体克隆成功完成了序列测定,并对序列进行了分析。分析发现,突变体ΔBcsec5中T-DNA插入基因编码一个预测蛋白,GenBank BLAST比对发现该预测蛋白与分泌系统exocyst复合体的一个亚基Sec5相似性较高。利用单孢分离,PCR鉴定实验获得了该突变体的单核转化子。RT-PCR分析表明该基因表达丧失,从而基因表达水平上确认基因功能的插入失活。该突变体表现为生长速率减缓,孢子萌发率降低,菌丝多蜷曲分枝,几丁质含量升高,对番茄叶片的致病能力减弱。转化子在含有CFW,SDS,sorbitol,NaCl,KC1或MgC12的PDA平板上的生长情况并未显示出与野生型有明显的区别。透射电镜观察该突变体,发现部分突变体细胞中出现含高电子密度物质的分泌囊泡。该现象可能与细胞的极性胞外分泌缺陷相关。以上证据表明,灰葡萄孢中SEC5基因参与了灰葡萄孢的生长发育性状的调控并参与了对寄主植物的致病性。克隆了SEC5的全长基因序列,包括启动子、转录区和终止序列,构建双元表达载体并转入农杆菌对该突变体菌株进行该基因遗传互补。并克隆了 SEC5的转录区序列,构建成功了该基因的GFP融合蛋白表达载体,将该载体转化农杆菌后用于蛋白的细胞定位实验。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 灰霉病的发生状况
• 1.2 灰葡萄孢致病分子机制研究进展
• 1.3 分泌系统exocyst复合体的研究进展
• 第二章 灰葡萄孢突变体的构建与鉴定
• 2.1 材料
• 2.1.1 供试菌株
• 2.1.2 载体
• 2.1.3 主要供试试剂及仪器
• 2.1.4 主要培养基
• 2.2 方法
• 2.2.1 农杆菌AGL-1感受态细胞制备及转化
• 2.2.2 农杆菌介导的灰霉转化
• 2.2.3 转化子基因组DNA提取
• 2.2.4 琼脂糖凝胶电泳检测
• 2.2.5 转化子的PCR分子鉴定
• 2.2.6 Southern blot分析T-DNA插入模式
• 2.2.7 转化子中T-DNA插入位点侧翼序列的克隆
• 2.2.8 转化子单异核鉴定
• 2.2.9 RT-PCR检测T-DNA插入的基因是否表达
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 灰葡萄孢转化子获得以及抗性稳定性检测
• 2.3.2 ΔBcsec5潮霉素抗性基因PCR鉴定显示阳性
• 2.3.3 Southern blot显示T-DNA为单拷贝插入
• 2.3.4 T-DNA旁侧序列分析
• 2.3.5 获得单核转化子
• 2.3.6 RT-PCR显示T-DNA插入的基因未表达
• 2.4 小结与讨论
• 第三章 灰葡萄孢sec5突变体ΔBcsec5的生物学性状分析
• 3.1 材料
• 3.1.1 供试菌株
• 3.1.2 主要供试试剂和仪器
• 3.2 方法
• 3.2.1 突变体ΔBcsec5的生物学表型鉴定
• 3.2.2 突变体ΔBcsec5的致病力测定
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 突变体ΔBcsec5的生物学表型
• 3.3.2 突变体ΔBcsec5的致病力
• 3.4 小结与讨论
• 第四章 突变体遗传互补和标记基因的功能研究
• 4.1 材料
• 4.1.1 供试菌株与载体
• 4.1.2 供试试剂和仪器
• 4.2 方法
• 4.2.1 灰葡萄孢SEC5基因克隆、入门载体pETHG-SEC5的构建
• 4.2.2 构建互补表达载体pCAMBIA-Bar-SEC5
• 4.2.3 突变体互补转化子的获得、鉴定及表型分析
• 4.2.4 Sec5与GFP融合蛋白表达载体pGWB505-SEC5的构建
• 4.2.5 Sec5与GFP融合蛋白的细胞定位观察
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 灰葡萄孢SEC5基因的克隆与入门载体构建
• 4.3.2 构建pCAMBIA-Bar-SEC5质粒
• 4.3.3 互补转化子的获得、鉴定及表型分析
• 4.3.4 构建pGWB505-SEC5质粒
• 4.3.5 Sec5与GFP融合蛋白的细胞定位观察
• 4.4 小结与讨论
• 第五章 结论与展望
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间发表的学术论文