论文摘要
【背景】供体特异性输注（Donor specific transfusion,DST）泛指在围移植术期通过给予受体输注供体来源的全血、脾淋巴细胞或其他细胞成分,从而延长移植物存活的一种治疗手段,至今已有30多年的研究历史。新近的多项研究表明,通过DST协同共刺激阻断（包括CD28/B7和CD40/CD40L）的治疗,在啮齿类动物模型中成功诱导移植耐受。ICOS作为CD28超家族中的第三成员,其配体B7h组成表达于B细胞表面。ICOS/B7h信号在排斥反应中的重要作用已为学界所公认。静息状态的B细胞是一种良好的供体抗原输注成分,有研究表明缺失共刺激能力的B细胞具有良好的致耐受性（Tolerogenic）。因此我们设想通过重组的ICOSIg融合蛋白在体外与供体来源的B细胞预孵育,从而阻断其与受体T细胞间的ICOS/B7h信号,并利用这种方式的DST进行相关的体内、体外实验研究。【方法】1.体外实验,通过流式细胞术确定ICOSIg与B细胞结合的饱和浓度,通过单向混合淋巴细胞反应检测ICOSIg靶定的B细胞刺激反应性T细胞增殖的能力。2.分别以BALB/c和C57BL/6小鼠为供、受体,建立小鼠颈部异位心脏移植模型,流式细胞术检测移植术后受体外周淋巴器官中ICOS的表达,对移植物进行组织病理学监测（包括HE、Masson、IHC染色）。3.移植术前给予受体ICOSIg靶定的供体B细胞和/或ICOSIg预输注。对于移植物存活超过100d的受体,进行第三方供体皮片移植实验,鉴定耐受的供体特异性。4.夹心ELISA法检测耐受鼠血清中Th1/Th2类细胞因子的浓度。5. RT-PCR法检测长期存活的移植物内Th1/Th2类细胞因子mRNA的水平。6.流式细胞术检测耐受鼠外周血中CD4+CD25+T细胞的亚群比例,检测移植术后7d受体引流淋巴结内T细胞的凋亡情况。7.通过磁珠分离法获取耐受鼠脾脏来源的不同细胞亚群,分别将其过继性转移给经300rad 60Co预照射的正常受体,24hr后给予同品系供体来源之心脏移植,观察转移性耐受的形成与否。【结果】1.重组ICOSIg融合蛋白与小鼠脾淋巴细胞能够良好结合,其饱和浓度在100μg/ml左右。2.在体外,ICOSIg靶定的B细胞无法刺激反应性T细胞的正常增殖;受体APCs呈递的ICOS/B7h信号可以部分恢复反应性T细胞的增殖活性;比较而言,直接识别途径的ICOS/B7h信号似乎对于T细胞的增殖作用更为显著。3.成功建立小鼠颈部异位心脏移植模型。通过ICOSIg靶定的供体B细胞预输注（ITBT）可以显著延长移植心在受者体内的存活,当且仅当ITBT和ICOSIg联合预处理后,75%的移植物存活超过100天。诱导获得之耐受具有供体特异性。4.耐受鼠的外周淋巴器官及移植物中均有不同程度的ICOS+细胞亚群存在,其外周血中CD4+CD25+ T细胞的亚群比例显著高于对照组（15.6±5.69 %,P<0.01）。5.与对照相比,ITBT + ICOSIg预处理的受体移植术后7d,其引流淋巴结中CD8+ T细胞凋亡比例显著高于对照组（19.53±5.10%,P<0.05）。6.与正常对照相比,未处理组受体移植术后7d,血清中IFN-γ水平显著提高（600.2±400.0 pg/ml VS 172.6±70.7 pg/ml,P<0.05）,而耐受鼠血清中IL-10水平则显著低于正常对照（563.5±153.7 pg/ml VS 2063.3±367.9 pg/ml,P<0.005）.7.与未处理组移植后7d的移植物相比,耐受鼠移植物内IL-2在mRNA水平低表达（IL-2Ratio:0.344±0.021,P<0.05）,而IL-10表达水平上调,（IL-10Ratio:0.910±0.038,P<0.05）。8.在过继性转移实验中证实,经>10×106 TSCs预输注,可诱导300rad 60Co预照射的正常受体产生转移性耐受,进一步分群发现介导转移性耐受产生的调节性细胞主要集中于CD4+T细胞亚群内,然而相同剂量的CD4+CD25-TSCs（5×106）预输注则无法介导转移性耐受产生。9.去除移植物后1个月,“耐受鼠”脾细胞介导转移性耐受的效率降低。【结论】1.体外实验结果显示,ICOSIg靶定的供体B细胞无法有效地刺激受体反应性,这表明直接识别途径中的ICOS/B7h信号,对于T细胞的正常增殖是不可或缺的。同时我们注意到,虽然通过间接识别途径呈递的该信号也可促进T细胞增殖,但与直接途径相比,其作用似乎较弱。2.体内实验中,我们通过ICOSIg靶定的供体B细胞和ICOSIg的同时输注,成功诱导了MHC完全不匹配小鼠的供体特异性心脏移植耐受。3.耐受的诱导及维持是一个动态调节的过程。通过预输注,我们在移植后7d受体的引流淋巴结内,找到了CD8+T细胞凋亡的证据。然而关于耐受的维持,无论是在外周血（CD4+CD25+T细胞比例）,在移植物（Th1/Th2类细胞因子的mRNA水平）,还是在耐受鼠的脾脏（转移性耐受）,更多的证据偏向于调节机制。数据显示,耐受鼠脾脏中的CD4+CD25+T细胞亚群对于转移性耐受的介导是至关重要的。4.同时我们发现移植物的存活本身对于维持Treg的克隆的大小也具有重要意义。以上结果可为临床诱导移植耐受的实践提供一些思路和参考。