雄烯二酮高产菌株的诱变育种及发酵性能研究

论文摘要

雄烯二酮（AD）是制备甾体激素类药物的重要中间体，可通过微生物选择性切除植物甾醇侧链制得。微生物法制取AD具有产品纯度高、生产成本低、周期短等特点，但也存在菌种转化能力普遍不高，底物甾醇在水中溶解度低等缺点。针对上述问题，本文通过诱变育种筛选出一株AD高产突变株分枝杆菌Mycobacterium sp．BD696-6，显著提高了AD产量和转化率，并且以有机相水相两液相培养系统作为发酵系统，明显提高了甾体底物的投料量。同时，研究了培养基组成以及发酵条件对转化的影响。研究的主要结论有：（1）采用紫外线诱变、硫酸二乙酯诱变以及两者复合诱变方法对分枝杆菌Mycobacterium sp．BD696进行诱变，筛选得到一株AD高产突变株分枝杆菌Mycobacterium sp．BD696-6，在甾醇添加量为6‰时，AD浓度最终达到2.33g/L，AD转化率为61.4％，比出发菌株提高13.5％。连续传代5次，生产稳定性良好。（2）通过单因素实验和正交实验，确定两相系统中有机相葵花油最佳添加浓度为20％，水相培养基最佳C、N、P源以及金属离子种类和浓度分别为：糖蜜6％，NH4NO3O.3％，（NH4）2HPO40.08％，FeSO4·7H2O 0.05 g/L，ZnSO4·7H2O 0.3g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L。在最佳培养基条件下以及甾醇添加量为6‰时，AD转化率达到84.0％，比原培养基条件下的转化率提高了22.4％。（3）通过单因素实验，确定了摇瓶发酵阶段的最适发酵条件是：液体种子培养时间66h，接种量12％，装液量50mL/250mL三角瓶，摇床转速220rpm，温度30～32℃，初始pH7.5。（4）在5L发酵罐中进行的放大培养试验验证了摇瓶发酵的高转化率。AD的转化率随着甾醇添加量的提高而有所降低，但总产量明显提高。甾醇添加量在8‰时，AD转化率在108h达到最高97.1％，此时产量为4.92g/L：甾醇添加量在16‰时，AD转化率在120h达到82.1％，此时产量高达8.33g/L。因此，适当提高甾醇的加量从经济角度考虑是可取的。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 致谢
• 第一章 引言
• 1.1 甾体药物的结构,分类,功能及制备方法
• 1.1.1 甾体化合物的结构
• 1.1.2 甾体激素类药物的分类及功能
• 1.1.3 甾体激素类药物的制备方法
• 1.2 雄烯二酮和雄二烯二酮
• 1.2.1 雄烯二酮和雄二烯二酮的功能作用
• 1.2.2 AD和ADD的传统制备方法
• 1.2.3 AD和ADD的微生物转化途径
• 1.2.4 微生物转化法生产AD（D）的国内外发展概况
• 1.3 本课题研究的目的、意义及主要内容
• 第二章 雄烯二酮高产菌株的诱变育种
• 2.1 引言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 菌种
• 2.2.2 主要试剂及设备
• 2.2.3 培养基和培养条件
• 2.2.4 实验方案
• 2.2.5 分析方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 紫外线诱变的致死率曲线
• 2.3.2 硫酸二乙酯（DES）诱变的致死率曲线
• 2.3.3 复合诱变菌株的筛选
• 2.3.4 出发菌株与突变株Mycobacterium sp.BD696-6的性能研究与比较
• 2.4 本章小结
• 第三章 突变株的发酵培养基优化
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 菌种
• 3.2.2 主要试剂及设备
• 3.2.3 培养基及培养条件
• 3.2.4 实验方案
• 3.2.5 检测方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 不同有机相对发酵的影响
• 3.3.2 不同浓度葵花油对发酵的影响
• 3.3.3 不同碳源对发酵的影响
• 3.3.4 不同浓度碳源对发酵的影响
• 3.3.5 不同氮源对发酵的影响
• 4NO₃对发酵的影响'>3.3.6 不同浓度NH₄NO₃对发酵的影响
• 3.3.7 不同磷酸盐对发酵的影响
• 4）₂HPO₄对发酵的影响'>3.3.8 不同浓度（NH₄）₂HPO₄对发酵的影响
• 3.3.9 碳源、氮源、磷酸盐正交实验结果
• 3.3.10 金属离子对发酵的影响
• 3.3.11 无机盐离子正交实验结果
• 3.4 本章小结
• 第四章 突变株的摇瓶发酵条件优化及5L罐发酵试验
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 菌种
• 4.2.2 主要试剂及设备
• 4.2.3 培养基及培养条件
• 4.2.4 实验方案
• 4.2.5 检测方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 摇瓶发酵条件优化
• 4.3.2 5L罐发酵研究
• 4.4 本章小结
• 第五章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 参考文献