邻苯二甲酸酯类环境激素的荧光免疫分析研究及应用

论文摘要

环境激素是一类会使人类及生物的内分泌系统发生紊乱的外来物质。它可以改变人类和生物的内分泌系统，导致生殖、发育和行为异常。邻苯二甲酸酯类化合物是一类重要的环境激素。主要作为增塑剂，应用于食品和建筑行业。实验数据显示很多邻苯二甲酸酯类化合物影响动物体的生殖和发育系统。近年来，随着塑料制品的大量生产和使用，邻苯二甲酸酯不断进入环境，已成为全球性的最普遍的一类环境污染物。广泛存在于大气、水体、土壤、生物体等自然环境中，在普通人群中均可检测到。目前对邻苯二甲酸类环境激素的监测主要有气相色谱、液相色谱和气质联用等技术。但色谱技术耗时长，所需设备昂贵。所以，很有必要开发一系列简单、快速、可靠、灵敏、花费低廉的检测邻苯二甲酸类环境激素的方法。免疫分析具有方便快捷、检测成本低、安全可靠等优点可以满足简单、快速、灵敏检测环境激素的要求。国内外有关免疫分析方法监测邻苯二甲酸酯类环境激素的较少。本文意在建立一系列检测环境样品中邻苯二甲酸酯类环境激素的免疫分析方法。选择5种邻苯二甲酸酯类环境激素（邻苯二甲酸二甲酯，邻苯二甲酸二乙酯，邻苯二甲酸二丙酯，邻苯二甲酸二丁酯，邻苯二甲酸二环己酯）作为研究对象，主要通过半抗原衍生物的设计和制备、全抗原和抗体的制备与表征，采用荧光免疫技术，建立了一系列快速灵敏检测邻苯二甲酸酯类环境激素的免疫分析方法，并应用于实际样品的测定。本工作取得了以下结果：1．以4-硝基邻苯二甲酸为原料，与丙醇发生酯化反应后，再通过还原反应，在邻苯二甲酸二丙酯的苯环上引入了氨基并保持了酯基结构。首次合成了邻苯二甲酸二丙酯半抗原衍生物，并通过1HNMR，IR和UV进行了表征；2．采用新的合成技术和提纯方法，在4种邻苯二甲酸酯类环境激素的苯环上引入了氨基。合成了邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二环己酯等4种酯的半抗原衍生物，各步产物均经1HNMR，IR和UV图谱分析确证；3．合成的5种半抗原衍生物通过与载体蛋白BSA偶联，制备了邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丙酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二环己酯等5种酯的新的人工全抗原，经荧光光谱、体系颜色变化和免疫实验确证偶联成功；4．通过免疫新西兰大白兔，对血清进行分离和提纯，制备了5种效价高、特异性好的抗邻苯二甲酸酯类环境激素的新抗体IgG；5．将制备和提纯的抗体应用于这五种邻苯二甲酸酯类环境激素的检测，首次建立了2种检测邻苯二甲酸二乙酯、1种检测邻苯二甲酸二甲酯，1种检测邻苯二甲酸二丙酯、3种检测邻苯二甲酸二丁酯、2种检测邻苯二甲酸二环己酯等9种免疫分析检测邻苯二甲酸酯类环境激素的新方法。建立的免疫分析方法均具有灵敏度高、选择性好、简单、快速等优点。应用于实际样品的测定，结果满意。具体内容如下：1)建立了固相抗原竞争荧光免疫法中的顺序饱和法测定环境激素邻苯二甲酸二乙酯（DEP）的方法。当邻苯二甲酸二乙酯浓度范围线性范围为6.0～6μg／L时，回归方程为：△F=24180.1-1144.9logC（C为DEP的浓度，μg／L），相关系数R2=0.997，方法检测限为1.0μg／L。当邻苯二甲酸二乙酯浓度范围为60～1000μg／L时，回归方程为：△F=38801.6-9230.9logC（C为DEP的浓度，μg／L），相关系数R2=0.998。邻苯二甲酸酯类环境激素的交叉反应率都在7％以下，应用于实际的自来水、上海市苏州河水等水样和一次性塑料袋溶出液中邻苯二甲酸二乙酯的测定，回收率在89.8％～109.9％之间，相对标准偏差小于12％，样品测定结果满意。2)建立了固相抗体竞争荧光免疫法中的平衡饱和法测定环境激素邻苯二甲酸二乙酯的方法。邻苯二甲酸二乙酯浓度在1.0～500μg／L时，回归方程为△F=11024.9-693.3logC（C为DEP的浓度，μg／L），线性相关系数R2=0.996。方法检测限为1.0μg／L，邻苯二甲酸酯类环境激素的交叉反应率都在10％以下，应用于实际的自来水、上海市苏州河水等水样和一次性塑料袋溶出液中邻苯二甲酸二乙酯的测定，回收率在90.2％～109.1％之间，相对标准偏差小于14％，样品测定结果满意。3)建立了固相抗原竞争荧光免疫法测定环境激素邻苯二甲酸二甲酯（DMP）的方法。邻苯二甲酸二甲酯浓度在0.1～300μg／L时，回归方程为△F=10381.3-658.9logC（C为DMP的浓度，μg／L），线性相关系数R2=0.998。方法检测限为0.1μg／L，邻苯二甲酸酯类环境激素的交叉反应率都在10％以下，应用于上海市苏州河水、自来水等水样和饮料瓶等溶出液中邻苯二甲酸二甲酯的测定，回收率在92.4％～108.2％之间，相对标准偏差小于13％，样品测定结果满意。4)建立了固相抗体竞争荧光免疫法中的平衡饱和法测定环境激素邻苯二甲酸二丙酯（DPrP）的方法。邻苯二甲酸二丙酯浓度在1.0～200μg／L时，回归方程为△F=6283.9-976.8logC（C为DPrP的浓度，μg／L），线性相关系数R2=0.996，方法检测限为1.0μg／L，邻苯二甲酸酯类环境激素的交叉反应率都在9％以下，应用于上海市苏州河水、自来水等水样和饮料瓶溶出液中的邻苯二甲酸二丙酯的测定，回收率在91.8％～109.4％之间，相对标准偏差小于13％，样品测定结果满意。5)建立了固相抗原竞争荧光免疫法中的平衡饱和法测定环境激素邻苯二甲酸二丁酯（DBP）的方法。邻苯二甲酸二丁酯浓度在0.1～100μg／L时，回归方程为△F=4881.7-193.0logC（C为DBP的浓度，μg／L），线性相关系数R2=0.998。方法检测限为0.05μg／L，邻苯二甲酸酯类环境激素的交叉反应率都在9％以下，应用于自来水、上海市苏州河水、塑料瓶装水等水样和饮料瓶溶出液中邻苯二甲酸二丁酯的测定，回收率在90.5％～107.5％之间，相对标准偏差小于13％，样品测定结果满意。6)建立了固相抗体竞争荧光免疫法中的平衡饱和法测定环境激素邻苯二甲酸二丁酯的方法。邻苯二甲酸二丁酯浓度在0.5～400μg／L时，回归方程为△F=6548.1-547.1logC（C为DBP的浓度，μg／L），线性相关系数R2=0.997。方法检测限为0.3μg／L，邻苯二甲酸酯类环境激素的交叉反应率都在9％以下，应用于自来水、上海市苏州河水、塑料瓶装水等水样和饮料瓶溶出液中邻苯二甲酸二丁酯的测定，回收率在90.1％～106.7％之间，相对标准偏差小于13％，样品测定结果满意。7)建立了固相抗体竞争荧光免疫法中的顺序饱和法测定环境激素邻苯二甲酸二丁酯的方法。邻苯二甲酸二丁酯浓度在0.1～300μg／L时，回归方程为△F=6206.5-744.7logC（C为DBP的浓度，μg／L），线性相关系数R2=0.995。方法检测限为0.02μg／L，邻苯二甲酸酯类环境激素的交叉反应率都在10％以下，应用于自来水、上海市苏州河水、塑料瓶装水等水样和饮料瓶溶出液中邻苯二甲酸二丁酯的测定，回收率在90.7％～108.8％之间，相对标准偏差小于13％，样品测定结果满意。8)建立了固相抗体竞争荧光免疫法中的顺序饱和法测定环境激素邻苯二甲酸二环己酯（DCHP）的方法。邻苯二甲酸二环己酯浓度在0.01～100μg／L时，回归方程为△F=4127.2-550.2logC（C为DCHP的浓度，μg／L），线性相关系数R2=0.998，方法检测限0.01μg／L，邻苯二甲酸酯类环境激素的交叉反应率都在7％以下，应用于自来水、上海市苏州河水、塑料瓶装水等水样和饮料瓶溶出液中邻苯二甲酸二环己酯的测定，回收率在90.6％～109.5％之间，测定的相对标准偏差小于11％，样品测定结果满意。9)建立了固相抗体竞争荧光免疫法中的平衡饱和法测定环境激素邻苯二甲酸二环己酯的方法。邻苯二甲酸二环己酯浓度在0.01～100μg／L时，回归方程为△F=3846.1-422.3logC（C为DCHP的浓度，μg／L），线性相关系数R2=0.997，方法检测限0.01μg／L，邻苯二甲酸酯类环境激素的交叉反应率都12％以下，应用于自来水、上海市苏州河水、塑料瓶装水等水样和饮料瓶溶出液中邻苯二甲酸二环己酯的测定，回收率在92.3％～108.4％之间，测定的相对标准偏差小于12％，样品测定结果满意。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论
• 1.1 课题研究背景
• 1.1.1 环境激素
• 1.1.2 环境激素的监测现状及意义
• 1.2 邻苯二甲酸酯类环境激素特征
• 1.2.1 邻苯二甲酸酯类激素的种类
• 1.2.2 邻苯二甲酸酯的危害
• 1.2.3 邻苯二甲酸酯对生态系统的影响
• 1.2.4 环境中的邻苯二甲酸酯类激素
• 1.3 邻苯二甲酸酯类环境激素的结构特征
• 1.4 邻苯二甲酸酯类激素的测定
• 1.4.1 色谱法测定
• 1.4.2 光学方法测定
• 1.4.3 免疫分析方法测定
• 1.5 本课题研究的意义、思路及创新点
• 第2章 五种邻苯二甲酸酯人工全抗原的合成与表征
• 2.1 基本原理
• 2.1.1 抗原及制备意义
• 2.1.2 抗原的制备方法
• 2.1.3 抗原制备的思路
• 2.2 实验仪器和试剂
• 2.2.1 实验仪器
• 2.2.2 实验试剂
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 邻苯二甲酸二甲酯抗原的制备
• 2.3.2 邻苯二甲酸二乙酯抗原的制备
• 2.3.3 邻苯二甲酸二丙酯抗原的制备
• 2.3.4 邻苯二甲酸二丁酯抗原的制备
• 2.3.5 邻苯二甲酸环己二酯抗原的制备
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 4-硝基邻苯二甲酸的性质研究
• 2.4.2 邻苯二甲酸二甲酯半抗原衍生物及全抗原的表征
• 2.4.3 邻苯二甲酸二乙酯半抗原衍生物及全抗原的表征
• 2.4.4 邻苯二甲酸二丙酯半抗原衍生物及全抗原的表征
• 2.4.5 邻苯二甲酸二丁酯半抗原衍生物及全抗原的表征
• 2.4.6 邻苯二甲酸二环己酯半抗原衍生物及全抗原的表征
• 2.4.7 合成实验条件的选择
• 2.5 抗原制备小结
• 第3章 五种邻苯二甲酸酯类环境激素的抗体制备
• 3.1 抗体制备原理
• 3.1.1 抗体及其产生机理
• 3.1.2 抗体基本结构
• 3.1.3 IgG抗体的特性及产生过程
• 3.1.4 抗体制备的思路
• 3.2 实验仪器和材料
• 3.2.1 实验仪器
• 3.2.2 实验材料
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 抗体的制备
• 3.3.2 抗体的纯化
• 3.3.3 抗体特异性的鉴定
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 邻苯二甲酸二甲酯抗体制备的结果与讨论
• 3.4.2 邻苯二甲酸二乙酯抗体制备的结果与讨论
• 3.4.3 邻苯二甲酸二丙酯抗体制备的结果与讨论
• 3.4.4 邻苯二甲酸二丁酯抗体制备的结果与讨论
• 3.4.5 邻苯二甲酸二环己酯抗体制备的结果与讨论
• 3.4.6 抗体产生条件的优化
• 3.5 抗体制备小结
• 第4章 固相抗原竞争荧光免疫法测定邻苯二甲酸二乙酯
• 4.1 前言
• 4.1.1 标记免疫分析方法简介
• 4.1.2 固相抗原竞争荧光免疫法测定DEP的原理
• 4.2 实验材料和仪器
• 4.2.1 实验仪器
• 4.2.2 实验材料与试剂
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 包被抗原的合成
• 4.3.2 固相抗原竞争荧光免疫分析方法的建立
• 4.3.3 固相抗原竞争荧光免疫分析方法反应条件的优化
• 4.3.4 固相抗原竞争荧光免疫分析方法特异性评价
• 4.3.5 方法准确性—样品测定和加标回收实验
• 4.4 结果与讨论
• 4.4.1 包被抗原与抗体的浓度确定
• 4.4.2 标记二抗的鉴定及浓度的选择
• 4.4.3 抗原包被时间的影响
• 4.4.4 免疫反应温育时间
• 4.4.5 pH的影响
• 4.4.6 离子强度的影响
• 4.4.7 表面活性剂Tween 20的浓度选择
• 4.4.8 标准曲线
• 4.4.9 方法特异性
• 4.4.10 方法准确性—样品测定和加标回收实验
• 4.5 结论
• 第5章 固相抗体竞争荧光免疫法测定邻苯二甲酸二乙酯
• 5.1 前言
• 5.2 实验材料和仪器
• 5.2.1 实验仪器
• 5.2.2 实验材料与试剂
• 5.3 实验方法
• 5.3.1 固相抗体竞争荧光免疫法的建立
• 5.3.2 固相抗体竞争荧光免疫分析方法反应条件的优化
• 5.3.3 固相抗体竞争荧光免疫分析方法特异性评价
• 5.3.4 方法准确性—样品测定和加标回收实验
• 5.4 结果与讨论
• 5.4.1 包被液和最佳抗体包被浓度确定
• 5.4.2 标记二抗的鉴定及浓度的选择
• 5.4.3 抗体包被时间的影响
• 5.4.4 免疫反应温育时间
• 5.4.5 pH的影响
• 5.4.6 离子强度的影响
• 5.4.7 表面活性剂Tween20的浓度选择
• 5.4.8 标准曲线
• 5.4.9 方法特异性
• 5.4.10 方法准确性—样品测定和加标回收实验
• 5.5 结论
• 第6章 固相抗原竞争免疫法测定邻苯二甲酸二甲酯
• 6.1 前言
• 6.2 实验材料和仪器
• 6.2.1 实验仪器
• 6.2.2 实验材料与试剂
• 6.3 实验方法
• 6.3.1 包被抗原的合成
• 6.3.2 固相抗原竞争荧光免疫分析方法的建立
• 6.3.3 固相抗原竞争荧光免疫分析方法反应条件的优化
• 6.3.4 固相抗原竞争荧光免疫分析方法特异性评价
• 6.3.5 方法准确性—样品测定和加标回收实验
• 6.4 结果与讨论
• 6.4.1 包被抗原与抗体的浓度确定
• 6.4.2 标记二抗浓度的选择
• 6.4.3 抗原包被时间的影响
• 6.4.4 免疫反应温育时间
• 6.4.5 pH的影响
• 6.4.6 离子强度的影响
• 6.4.7 表面活性剂Tween 20的浓度选择
• 6.4.8 标准曲线
• 6.4.9 方法特异性
• 6.4.10 方法准确性—样品测定和加标回收实验
• 6.5 结论
• 第7章 固相抗体竞争荧光免疫法测定邻苯二甲酸二丙酯
• 7.1 前言
• 7.2 实验材料和仪器
• 7.2.1 实验仪器
• 7.2.2 实验材料与试剂
• 7.3 实验方法
• 7.3.1 固相抗体竞争荧光免疫分析方法的建立
• 7.3.2 荧光二抗的标记
• 7.3.3 固相抗体竞争荧光免疫分析方法反应条件的优化
• 7.3.4 固相抗体竞争荧光免疫分析方法特异性评价
• 7.3.5 方法准确性—样品测定和加标回收实验
• 7.4 结果与讨论
• 7.4.1 荧光标记二抗的鉴定
• 7.4.2 包被液和pH值的确定
• 7.4.3 标记二抗浓度的选择
• 7.4.4 抗体包被时间的影响
• 7.4.5 免疫反应温育时间
• 7.4.6 离子强度的影响
• 7.4.7 表面活性剂Tween 20的浓度选择
• 7.4.8 标准曲线
• 7.4.9 方法特异性
• 7.4.10 方法准确性—样品测定和加标回收实验
• 7.5 结论
• 第8章 固相抗原竞争荧光免疫法测定邻苯二甲酸二丁酯
• 8.1 前言
• 8.2 实验材料和仪器
• 8.2.1 实验仪器
• 8.2.2 实验材料与试剂
• 8.3 实验方法
• 8.3.1 包被抗原的合成
• 8.3.2 固相抗原竞争荧光免疫分析方法的建立
• 8.3.3 荧光二抗的标记
• 8.3.4 固相抗原竞争荧光免疫分析方法反应条件的优化
• 8.3.5 固相抗原竞争荧光免疫分析方法特异性评价
• 8.3.6 方法准确性—样品测定和加标回收实验
• 8.4 结果与讨论
• 8.4.1 包被抗原与抗体的浓度确定
• 8.4.2 标记二抗的鉴定及浓度的选择
• 8.4.3 抗原包被时间的影响
• 8.4.4 免疫反应温育时间
• 8.4.5 pH的影响
• 8.4.6 离子强度的影响
• 8.4.7 表面活性剂Tween 20的浓度选择
• 8.4.8 标准曲线
• 8.4.9 方法特异性
• 8.4.10 方法准确性—样品测定和加标回收实验
• 8.5 结论
• 第9章 固相抗体竞争荧光免疫法测定邻苯二甲酸二丁酯——平衡饱和法
• 9.1 前言
• 9.2 实验材料和仪器
• 9.2.1 实验仪器
• 9.2.2 实验材料与试剂
• 9.3 实验方法
• 9.3.1 固相抗体竞争荧光免疫分析方法的建立
• 9.3.2 荧光二抗的标记
• 9.3.3 固相抗体竞争荧光免疫分析方法反应条件的优化
• 9.3.4 固相抗体竞争荧光免疫分析方法特异性评价
• 9.3.5 方法准确性—样品测定和加标回收实验
• 9.4 结果与讨论
• 9.4.1 包被液和pH值的确定
• 9.4.2 标记二抗的鉴定及浓度的选择
• 9.4.3 抗体包被时间的影响
• 9.4.4 免疫反应温育时间
• 9.4.5 离子强度的影响
• 9.4.6 表面活性剂Tween 20的浓度选择
• 9.4.7 标准曲线
• 9.4.8 方法特异性
• 9.4.9 方法准确性—样品测定和加标回收实验
• 9.5 结论
• 第10章 固相抗体竞争荧光免疫法测定邻苯二甲酸二丁酯——顺序饱和法
• 10.1 前言
• 10.2 实验材料和仪器
• 10.2.1 实验仪器
• 10.2.2 实验材料与试剂
• 10.3 实验方法
• 10.3.1 固相抗体竞争荧光免疫分析方法的建立
• 10.3.2 荧光二抗的标记
• 10.3.3 固相抗体竞争荧光免疫分析方法反应条件的优化
• 10.3.4 固相抗体竞争荧光免疫分析方法特异性评价
• 10.3.5 方法准确性—样品测定和加标回收实验
• 10.4 结果与讨论
• 10.4.1 荧光免疫主要条件的优化
• 10.4.2 标准曲线
• 10.4.3 方法特异性
• 10.4.4 方法准确性—样品测定和加标回收实验
• 10.5 结论
• 第11章 固相抗体竞争荧光免疫法测定邻苯二甲酸二环己酯——顺序饱和法
• 11.1 前言
• 11.2 实验材料和仪器
• 11.2.1 实验仪器
• 11.2.2 实验材料与试剂
• 11.3 实验方法
• 11.3.1 固相抗体竞争荧光免疫分析方法的建立
• 11.3.2 荧光二抗的标记
• 11.3.3 固相抗体竞争荧光免疫分析方法反应条件的优化
• 11.3.4 固相抗体竞争荧光免疫分析方法特异性评价
• 11.3.5 方法准确性—样品测定和加标回收实验
• 11.4 结果与讨论
• 11.4.1 包被抗体和标记二抗浓度确定
• 11.4.2 pH的影响
• 11.4.3 免疫反应温育时间
• 11.4.4 离子强度的影响
• 11.4.5 表面活性剂Tween 20的浓度选择
• 11.4.6 标准曲线
• 11.4.7 方法特异性
• 11.4.8 方法准确性—样品测定和加标回收实验
• 11.5 结论
• 第12章 固相抗体竞争荧光免疫法测定邻苯二甲酸二环己酯——平衡饱和法
• 12.1 前言
• 12.2 实验材料和仪器
• 12.2.1 实验仪器
• 12.2.2 实验材料与试剂
• 12.3 实验方法
• 12.3.1 固相抗体竞争荧光免疫分析方法的建立
• 12.3.2 荧光二抗的标记
• 12.3.3 固相抗体竞争荧光免疫分析方法反应条件的优化
• 12.3.4 固相抗体竞争荧光免疫分析方法特异性评价
• 12.3.5 方法准确性—样品测定和加标回收实验
• 12.4 结果与讨论
• 12.4.1 荧光免疫主要条件的优化
• 12.4.2 标准曲线
• 12.4.3 方法特异性
• 12.4.4 方法准确性—样品测定和加标回收实验
• 12.5 结论
• 总结与展望
• 参考文献
• 攻读博士期间发表和待发表论文及申请专利
• 致谢