杨颖谕云南省曲靖市第一人民医院病理科655000
【摘要】目的：分析淋巴瘤亚型检测中免疫组化双染技术的应用策略。方法：选取反应性增生淋巴组织8例，淋巴瘤组织35例的标本作为具体的研究对象，采用免疫组化双染技术对淋巴瘤亚型进行检测，并对检测结果进行分析和对比。结果：在所选择的淋巴组织中，所选择的淋巴组织中B淋巴细胞CD20阳性呈红色，CD79a阳性呈棕色，T淋巴细胞CD3阳性呈棕色，CD45RO阳性呈红色。经过（CD45RO+CD79a）以及T/B（CD3+CD20）淋巴细胞免疫组织化双染之后，可以对淋巴瘤中的T淋巴细胞以及B淋巴细胞进行清晰的辨认，并准确判断出淋巴瘤的具体种类。讨论：免疫组化双染技术在淋巴瘤亚型检测中具有极高的检测价值，可以判断出淋巴瘤的具体种类，值得在临床检测科中推广并大力应用。
【关键词】淋巴瘤亚型检测；免疫组化双染技术；应用
淋巴瘤属于一种恶性肿瘤，它主要是来源于前体细胞以及淋巴细胞，数据调查分析显示，近年当中，该病发病率呈现上升的趋势，给人类的身心造成造成极大的痛苦和危害[1]。在临床中，如果仅在免疫组化单一标记以及HE染色的基础上来对该病进行诊断具有一定的难度，特别是在遇到肿瘤细胞中存在较多的B淋巴细胞以及T淋巴细胞的情况下。免疫组化双染技术是一种有效的检测方法，临床上经常会使用其对淋巴瘤亚型进行检测，具有极高的诊断价值。现本文主要是探讨免疫组化双染技术的具体应用策略，具体如下。
1.一般资料和方法
1.1一般资料
选取有反应性增生性淋巴组织8例，淋巴瘤组织患者35例的标本作为具体的研究对象。所有患者的淋巴组织标本均全部使用10％中性福尔马林来进行固定，然后进行常规石蜡包埋，切片厚度为4。一抗中包括有CD3（兔抗人）、CD20（鼠抗人）以及CD45RO（鼠抗人）CD79a（兔抗人）。
1.2方法
根据特征采取以下步骤进行检测：1.首先要对石蜡进行切片，接着把这些切片进行脱蜡至水。2.经过高压以及高温的抗原修复之后，对其进行大约2分钟的喷剂，等待自然冷却之后，用水冲洗[2-3]。3.使用PBS（pH7.4）进行冲洗三次，每次大约三分钟，把PBS除去后，加入大约百分之三的H2O2溶液，放在室温内进行孵育大约十分钟左右。4.分别使用蒸馏水和PBS（pH7.4）进行冲洗三次每次大约三分钟。5.把试剂1加入后进行封闭，湿盒进行孵育大约十分钟。6.把液体除掉，免洗，在切片上加入足够量的一抗混合，进行湿盒孵育并且过夜。7.使用PBS（pH7.4）进行冲洗三次，每次大约三分钟，把PBS除去后，把两种二抗（AP标记山羊抗小鼠IgG聚合物）和HRP标记山羊抗兔IgG聚合物）根须实际所需的比例来进行混合，在三十七摄氏度下进行湿盒孵育大约半个小时，使用PBS（pH7.4）进行冲洗三次，每次大约三分钟[4-5]。8.在组织上加入足够量的DAB显色液，在镜下显色大约三分钟后，蒸馏水终止反应。9.使用AP-Red
工作液加入到每一张切片中，保证液量足以覆盖切片。10.使用无醇苏木精复染大约十五秒，接着用自来水进行冲洗，并放入到PBS中进行返蓝。11.对组织滴加足够量的封片剂，保证封片剂可以均匀的覆盖组织，把切片进行水平放置，放置到三十七摄氏度的烤箱中大约三小时，一直到其完全变干为止。
2.结果
在所选择的淋巴组织中，B淋巴细胞CD20阳性呈红色，CD79a阳性呈棕色，T淋巴细胞CD3阳性呈棕色，CD45RO阳性呈红色。经过（CD45RO+CD79a）以及T/B（CD3+CD20）淋巴细胞免疫组织化双染之后，可以对淋巴瘤中的T淋巴细胞以及B淋巴细胞进行清晰的辨认，可以准确判断出淋巴瘤的具体种类。
3.讨论
淋巴瘤属于一种恶性肿瘤，近年来发病率极高，及早诊断和治疗显得尤为关键和重要。在临床中，如果仅在免疫组化单一标记以及HE染色的基础上来对该病进行诊断具有一定的难度，特别是在遇到肿瘤细胞中存在较多的B淋巴细胞以及T淋巴细胞的情况下[6]。现今免疫组化技术是肿瘤诊断的最常用手段之一，主要包括有SP法、LDP法、EPOS法、CSAPAP法、ABC法等等。这些方法经常被用于检测组织细胞中其中一种抗原成分。如果要想弄清楚同一细胞组织内两种抗原相互之间的关系，则需要对免疫组化进行双重标记。使用T/B（CD3+CD20）和T/B（CD45RO+CD79a）淋巴细胞免疫组化双染技术能够在同一张切片上清晰的显示出两种特异性的抗原表达，让诊断医师可以很清楚的辨别出T淋巴细胞和B淋巴细胞，并判断出那些属于良性增生，哪些属于肿瘤细胞，避免误诊、漏诊现象的发生，为临床下一步治疗提供正确的指导依据，提高治疗的针对性。
免疫组化双染技术以不同的酶系统催化不同显色底物来呈现出不同的颜色，可以在同一张组织切片中对两种不同的抗原进行表达。该技术具有操作简单方便、实用、灵敏度高、特异性高等特点，具有其它检测技术无法比拟的优点。一般来说，使用该技术应该要注意两个基本点：1.为了要防止交叉反应的发生，应该要正确选择不同的酶。2.应该要尽可能的选择两种色彩对比较为鲜明的两种色组作为显色的底物。两种抗原所使用的方法一般来说是一样的，同一张组织切片在整个双染的过程当中修复仅为一次。此外，在整个技术操作的过程当中，应该要把握好每一个环节，才可以确保最终的检测质量，帮助患者做出最准确的判断。
当前，在免疫组化双染技术中，经常会采用间接－异种动物抗体方法。即一抗分别由不同的动物来产生，而二抗也在针对一抗的基础上来由不同的动物产生。采用该方法可以混合起所有不同的一抗和二抗进行混合，不但大大的节约了时间，且染色的最终效果佳，避免了交叉反应现象的发生。在这次试验当中，对T/B的判读就属于这类情况，由于使用了兔和鼠的一抗，二抗分别抗兔和抗鼠，在把四种最佳抗体匹配寻找出来后在进行稀释，有效的避免交叉现象的发生或者是把交叉反应发生的可能性控制在最低。使用免疫组化双染技术，可以对细胞的分化具体程度、表面抗原以及具体类别等进行更加深入的研究。
进行免疫组化双染技术的时候，应当遵循以下原则：免疫组化阳性表达部位可在细胞质和细胞核，细胞膜、按照抗体所表达出来的的阳性部位不同，如果同时进行两到三种抗体且有间标或者直标的，应首先做好间标抗体后做直标抗体，且需要注意抗原性的强与弱，根据顺序来由弱到强进行标记。采用免疫组化双染技术，不管是选用BCIP/NBT-AEC底物显色或者是DAB-固红搭配底物，都需要通过鲜明的颜色对比对结果进行判断。如果两种抗原同时存在同一个细胞核或者细胞质中，则镜下显示出来的是两种染色的相互重叠，这种现象会给结果产生影响。此时，可以分别在进行以下两种抗体，分别采取灵敏度和抗原特异性更强的T/B（CD3+CD20）和T/B（CD45RO+CD79a）组合，进一步对抗原提进行明确，从而得出更加精准的结果。
在本次研究结果中，我们可知道，B淋巴细胞CD20阳性呈红色，CD79a阳性呈棕色，T淋巴细胞CD3阳性呈棕色，CD45RO阳性呈红色。经过（CD45RO+CD79a）以及T/B（CD3+CD20）淋巴细胞免疫组织化双染之后，可以对淋巴瘤中的T淋巴细胞以及B淋巴细胞进行清晰的辨认，可以准确判断出淋巴瘤的具体种类。结果证明，免疫组化双染技术诊断价值高，值得患者及其家属的信赖，值得在临床中大力推广并且使用。
参考文献：
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