表达外源基因的HCV微型基因组的构建及初步应用研究

论文摘要

病毒基因组复制是其生活周期中的重要环节。已知正链RNA病毒的复制分为两个步骤,一是正链RNA作为模板生成复制中间体负链RNA;二是负链RNA又作为模板去合成子代正链RNA。复制酶是依赖RNA的RNA聚合酶（RdRP）,非编码区（UTR）是病毒基因组复制的主要调控区域,其中3′UTR是复制酶结合的主要区域,介导基因组的从头合成。在深入理解病毒复制机制及复制所需作用元件的基础上,构建RNA病毒微型基因组是近年来分子病毒学研究的一个热点方向。它有利于阐明病毒复制的分子机制、成熟与包装中所需的蛋白因子,并为抗病毒药物的设计提供新策略。丙型肝炎病毒（HCV）属黄病毒科,为单股正链RNA病毒。HCV基因组全长约9.6Kb,含有单一开放读框（ORF）,两侧为非编码区（5′UTR和3′UTR）。HCV基因组具有高度变异性,存在“准株”现象,主要有六个基因型和多个亚型。而HCV基因组序列分析表明,与复制密切相关的顺式作用元件高度保守,它们主要存在于5′UTR和3′UTR,以及core和ns5b基因的部分序列。NS5B蛋白具有RdRP活性,是HCV复制的关键酶。它与其它非结构区蛋白（如NS3、NS4A、NS4B等）形成复制酶复合物,锚定于细胞中内质网膜上发挥其生物功能。这一系列研究为构建HCV微型基因组提供了条件。新型HCV治疗药物是各国学者研究的热点。目前关于HCV的治疗是主要以干扰素为基础的治疗方案,但效果有限而且副作用大,患者依从性差。具有很大潜力的小分子药物,如针对NS3/4A蛋白酶、解旋酶及RNA聚合酶NS5B的抑制剂,临床试验显示常常引起耐药突变体。因此,迫切需要寻找新的抗HCV策略,其中靶向治疗HCV感染细胞的方法是有潜力的方向之一。本研究首先通过基因重组技术用顺式作用元件构建了HCV微型基因组,中间为反向插入的萤火虫荧光素酶报告基因（firefly luciferase,flu）与EMCV的IRES基因。该微型基因组RNA在病毒复制酶的作用下,从3′末端起始合成负链RNA,反向插入的flu及IRES基因即转换为正向,flu得以表达。然后,设计了几种不同截短的微型基因组,由它们生成的负链RNA的3′末端具有不同茎环截短的突变形式,以报告基因flu的表达水平来比较这一系列微型基因组。在此基础上,利用该微型基因组表达IFN-β,靶向抑制HCV感染细胞。本研究分以下三个部分:1. HCV微型基因组的构建与功能鉴定根据Genbank登录的HCV 1b型基因序列,设计引物分别扩增HCV 5UTR1-377、3UTR,其中扩增5UTR1-377的引物上游含有T7启动子核心序列;分别设计并扩增IRES（来自EMCV）、flu基因;合成HDV核酶Rz（ribozyme）的正义与反义序列,两者退火;将PCR产物各片段克隆至pMD18T载体,交由公司测序。序列鉴定正确后依次将5UTR、IRES、3UTR、HDV Rz片段克隆入pUC18载体,形成质粒pUC18-T7/5UTR-rIRES-3UTR-HDV Rz,缩写为pT7/5UrI3URz。然后通过Xba I单酶切位点将flu基因插入上述载体,PCR鉴定正反向后,命名反向插入flu的载体为pT7/5UrFI3URz,即为HCV微型基因组。HCV复制子质粒BB7经Sca I酶切线性化,在T7 RNA聚合酶作用下体外转录制备RNA,通过电穿法转染Huh7.5细胞,经G418压力筛选获得稳定细胞克隆,RT-PCR和Western blot证实成功构建了该复制子细胞系,命名为Huh7.5BB7。将pT7/5UrFI3URz质粒经EcoR ?酶切线性化,体外转录制备微型基因组RNA,通过电穿转染方法将其导入Huh7.5BB7细胞和Huh7.5细胞,48hr后处理细胞进行荧光素酶活性测定。实验结果表明,荧光素酶选择性表达于Huh7.5BB7细胞,提示已成功构建HCV微型基因组。2.不同HCV微型基因组截短体的比较从3′末端起始的从头合成是HCV复制的形式。负链RNA 3′UTR的二级结构已经解析,除了3′末端的最短的SL-A1茎环外,其它茎环与正链RNA 5′UTR均不同。目前,对于负链RNA 3′UTR的各个茎环在正链RNA的从头合成中作用尚不清楚。本研究依次构建了几种截短的微型基因组（?45、?124、?227、?131-315）,由它们生成的负链RNA的3′末端具有不同茎环截短的突变形式。将这几种微型基因组体外转录制备微型基因组RNA,转染Huh7.5BB7细胞。48 hr后测定荧光素酶活性,结果显示:与全长微型基因组相比,?131-315微型基因组表达荧光素酶活性增强（p<0.01）,而?45微型基因组表达荧光素酶活性降低（p<0.01）,?124、?227微型基因组基本不表达荧光素酶。3.利用微型基因组特异表达IFN-β靶向抑制HCV感染细胞长效干扰素（PEG-IFN）联合利巴韦林是目前HCV最为标准的治疗方案。但各个基因型的持续病毒学应答率（SVR）不同,1型和4型仅为3852%。其中一个重要原因是HCV编码蛋白通过多种途径抵抗了IFN的抗病毒反应。本研究将IFN-β基因反向插入微型基因组,当其进入细胞内,在病毒复制酶作用下合成负链微型基因组RNA后启动IFN-β表达,从而发挥抗病毒作用。首先从外周血中分离淋巴细胞,用poly I:C刺激其分泌IFN。用Trizol提取细胞总RNA,逆转录合成cDNA,PCR扩增IFN-β基因。序列鉴定正确后,将其克隆入pT7/5U?131-315rI3URz,PCR鉴定插入的正反向,将反向插入的质粒命名为pT7/5U?131-315rIFNI3URz。该重组质粒用EcoR I酶切后纯化,体外转录制备RNA,转染Huh7.5BB7细胞,48hr后收集细胞并提取蛋白。抗IFN-β抗体作为一抗,Western-blot分析显示:IFN-β特异性表达于复制子细胞中。用Xba I线性化HCV全长基因组质粒JFH-1后,体外转录制备RNA并转染Huh7.5细胞,In cell Western-blot和荧光实时定量PCR证实建立了Huh7.5JFH-1细胞系。为了利用HCV微型基因组进行靶向基因治疗,设计引物扩增微型基因组5U?131-315rIFNI3URz后克隆入pcDNA3.1载体,获得pCMV-5U?131-315rIFNI3URz。将其转染复制子细胞系,Western-blot显示IFN-β能够特异的表达于复制子细胞系中。pCMV-5U?131-315rIFNI3URz转染huh7.5JFH-1细胞系后,荧光实时定量PCR显示,它可以降低HCV RNA的拷贝水平,具有一定的剂量依赖效应。综上所述,本研究成功构建了HCV微型基因组,对其表达外源基因的构建方式进行了优化;携带IFN-β的微型基因组能够靶向表达于HCV感染细胞,并可降低病毒RNA复制水平。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 1. HCV 的基因组结构
• 2. HCV RNA 的复制机制
• 3. HCV 微型基因组研究
• 4. IFN 与抗 HCV 研究
• 正文
• 第一部分 HCV 微型基因组及截短体的构建与功能鉴定
• 1. 材料
• 2. 方法
• 3. 结果
• 4. 讨论
• 第二部分 运用HCV 微型基因组表达IFN-β靶向治疗病毒感染细胞
• 1. 材料
• 2. 实验方法
• 3. 结果
• 4. 讨论
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 个人简历和研究成果
• 致谢