东亚飞蝗海藻糖合成酶基因的克隆与功能研究

论文摘要

海藻糖在细菌、真菌、昆虫、无脊椎动物等大量生物中都存在,它不仅可以作为碳源和能源的主要来源,而且在抵抗高温、低温、缺水等逆境方面起着重要的作用。海藻糖合成酶（TPS）是海藻糖合成过程中的一个关键酶。有关细菌和真菌的海藻糖合成酶的报道已经比较多,大量编码海藻糖合成酶的cDNA序列也得到了克隆。但是昆虫中只有少数几个物种的海藻糖合成酶基因的cDNA序列得到了克隆,有关其功能的报道更是少数。我们从东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis的脂肪体中克隆得到了海藻糖合成酶基因,并对其组织表达和功能进行了初步研究,取得了如下进展:①东亚飞蝗海藻糖合成酶（LmTps）基因的克隆通过RACE方法,克隆了东亚飞蝗海藻糖合成酶（LmTps）cDNA全序列（登录号:EU131894）。获得的cDNA全长2806bp,其中包括2442bp的开放阅读框,共编码813个氨基酸,预测的分子量和等电点分别为91 976D和6.14。该氨基酸序列和已经公布的其他昆虫的海藻糖合成酶基因有很高的相似性,并且它的C端与海藻糖磷酸化酶（TPP）基因也有着高度同源区域。②LmTps基因的组织表达分析本研究通过半定量RT-PCR研究LmTps的组织表达情况,分别取五龄幼虫的脂肪体、肠道、血液和腿部肌肉进行实验。结果表明,海藻糖合成酶不仅在蝗虫的脂肪体中表达,而且在肠道、血液和腿部肌肉中都有转录。③东亚飞蝗的RNAi根据得到的cDNA序列设计了一段902bp的片段,体外转录成dsRNA后注射东亚飞蝗,发现实验组与对照组相比,海藻糖浓度从第4天开始明显下降,并且持续到第14天。海藻糖的这种变化很可能是由LmTps的转录水平降低引起的。④酿酒酵母互补实验为了对克隆得到的海藻糖合成酶cDNA序列进行进一步的功能验证,我们用PFL61载体将得到的cDNA序列转入酿酒酵母海藻糖合成酶基因tps1缺失突变株YSH290,结果使得它在葡萄糖培养基平板上无法生长的性状得到了恢复,说明LmTps可以部分或完全的在酿酒酵母中发挥海藻糖合成酶的功能。⑤LmTps在毕赤酵母中的表达将LmTps基因编码框连接到表达载体pPIC9K的多克隆位点上,构建了pPIC9K-LmTps重组表达质粒。重组质粒经电穿孔法转化入毕赤酵母表达菌株KM71,PCR方法检测重组情况,筛选阳性转化子。转化子在甲醇的诱导下表达,表达产物上清液中检测到了约91kD的目的条带,说明LmTps基因可能在上清液中得到了表达。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 研究背景及进展
• 1.2.1 海藻糖研究进展
• 1.2.2 海藻糖合成途径及其相关基因
• 1.2.3 海藻糖合成酶研究进展
• 1.3 研究目的
• 1.4 研究内容及技术路线
• 1.4.1 研究内容
• 1.4.2 技术路线
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 供试昆虫
• 2.1.2 菌株和载体
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.1.4 主要试剂
• 2.1.5 主要溶液配制
• 2.2 东亚飞蝗海藻糖合成酶（LmTps）基因的克隆及序列分析
• 2.2.1 东亚飞蝗TPS 基因同源片段的PCR 扩增、克隆及序列测定
• 2.2.2 3’RACE 扩增东亚飞蝗TPS 基因3’端
• 2.2.3 5’RACE 扩增东亚飞蝗TPS 基因5’端
• 2.2.4 Lm Tps 的扩增序列的拼接与分析
• 2.3 东亚飞蝗海藻糖合成酶（LmTps）基因的组织表达分析
• 2.4 东亚飞蝗海藻糖合成酶（LmTps）基因的RNAi 研究
• 2.5 LmTps 基因的酿酒酵母突变株功能互补研究
• 2.5.1 酿酒酵母重组表达质粒PFL61/LmTps 的构建
• 2.5.2 Saccharomyces cerevisiae/ PFL61-LmTps 工程菌株的构建
• 2.5.3 酿酒酵母转化子的表型研究
• 2.6 东亚飞蝗海藻糖合成酶酶（LmTps）基因在毕赤酵母中的表达
• 2.6.1 pPIC9K-LmTps 重组表达质粒的构建
• 2.6.2 Pichia pastoris/ pPIC9K-LmTps 工程菌株的构建与筛选
• 2.6.3 Pichia pastoris/ pPIC9K-LmTps 在KM71 中的诱导表达
• 3 结果与分析
• 3.1 东亚飞蝗海藻糖合成酶基因（LmTps）的克隆与分析
• 3.1.1 东亚飞蝗TPS 基因同源片段扩增结果
• 3.1.2 东亚飞蝗TPS 基因3’RACE 扩增结果
• 3.1.3 东亚飞蝗TPS 基因5’RACE 扩增结果
• 3.1.4 东亚飞蝗扩增序列拼接结果及分析
• 3.2 东亚飞蝗海藻糖合成酶（LmTps）基因的组织表达分析
• 3.3 东亚飞蝗海藻糖合成酶（LmTps）基因的RNAi 研究
• 3.4 LmTps 基因的酿酒酵母突变株互补研究
• 3.4.1 酿酒酵母重组表达质粒PFL61/LmTps 的构建
• 3.4.2 Saccharomyces cerevisiae/ PFL61-LmTps 工程菌株的构建
• 3.4.3 酿酒酵母转化子的表型研究
• 3.5 LmTps 在毕赤酵母中的表达
• 3.5.1 pPIC9K-LmTps 重组表达质粒的构建
• 3.5.2 Pichia pastoris/ pPIC9K-LmTps 工程菌株的构建与筛选
• 3.5.3 Pichia pastoris/ pPIC9K-LmTps 在KM71 中的诱导表达
• 4 讨论
• 4.1 东亚飞蝗海藻糖合成酶（LmTps）基因克隆
• 4.2 东亚飞蝗海藻糖合成酶（LmTps）基因的组织表达分析
• 4.3 东亚飞蝗中肠海藻糖合成酶（LmTps）基因的功能研究
• 4.4 小结
• 5 结论及后续工作建议
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• A. 作者在攻读硕士学位期间发表的论文目录
• B. 作者在攻读硕士学位期间参加的科研项目