论文摘要
背景与目的:胃癌是最常见的恶性肿瘤之一。在世界范围内,胃癌是第四大最常见恶性肿瘤,居恶性肿瘤死亡原因的第二位。虽然早期胃癌术后5年生存率可达95%以上,但大多数患者在就诊时己经处于进展期。进展期胃癌由于手术切除率低,放化疗毒副作用大,肿瘤多药耐药等问题,其疗效仍难以令人满意,所以寻找一种新的治疗方法成为目前胃癌研究的一个重要课题。随着肿瘤分子生物学技术及基因工程的发展,基因治疗为恶性肿瘤提供了一种新的治疗手段,其中自杀基因治疗因毒副作用小和强大的旁观者效应备受关注。自杀基因治疗（suicide gene therapy）是将能编码某种特殊酶的基因导入肿瘤细胞,使无毒的前药代谢为细胞毒性活性代谢产物,从而引起肿瘤细胞死亡,并通过旁观者效应杀伤其周围细胞。胞嘧啶脱氨酶:尿嘧啶磷酸核糖转移酶/5-氟胞嘧啶（cytosine deaminase:uracilphosphoribosyltransferase/5-Fluorocytosine,CD:UPRT/5-FC）融合自杀基因系统由CD/5-FC自杀基因系统发展而来。CD基因产物将无毒的5-FC转变为有细胞毒性的5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil,5-FU）从而发挥抗瘤作用。但是CD/5-FC系统在有些肿瘤的治疗中效果不理想,这些细胞表现出对5-FU的一定程度的耐药。尿嘧啶磷酸核糖转移酶（uracil phosphoribosyltransferase,UPRT）是来源于细菌等微生物中的一种嘧啶补救酶,能直接催化5-FU转化为5-FUMP,从而显著提高5-FU的疗效,并可逆转肿瘤细胞对5-FU的继发耐药。CD:UPRT/5-FC系统在结肠癌、前列腺癌、卵巢癌中均取得显著疗效,在胰腺癌的治疗中的效果不理想,其对胃癌的治疗效果未见报道。靶向性问题是目前基因治疗的关键问题之一,达到基因治疗靶向性的常用策略之一是靶向性转录,即利用肿瘤或组织特异性启动子作为顺式作用元件,调控下游目的基因转录,从而使目的基因仅在特定的细胞中表达,达到靶向治疗的目的。目前常用的启动子有癌胚抗原（CEA）启动子、甲胎蛋白（AFP）启动子、MUC1启动子等,但是它们有些在胃癌中的阳性率较低,有些在胃癌中的转录活性较弱,从而限制了它们在胃癌基因治疗中的应用。端粒酶是一种广谱的肿瘤标志物,它可以通过在真核细胞染色体的端粒上添加特殊的序列（端粒重复序列）来延长和稳定端粒,在细胞永生化及恶性肿瘤的发生发展过程中起重要作用。85%以上的人类肿瘤细胞具有端粒酶活性,而绝大多数正常体细胞无端粒酶活性。人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase,hTERT）是端粒酶的催化亚单位,是端粒酶活性的主要决定因素。研究表明,hTERT的表达调控主要发生在转录水平,因此hTERT启动子可作为顺式作用元件调控下游基因在端粒酶阳性的肿瘤细胞中特异性的表达。本研究的目的是探讨hTERT启动子调控的CD:UPRT/5-FC融合自杀基因系统体内外靶向杀伤胃癌细胞的可能性及方法,为胃癌的基因治疗提供新的思路。方法:1、以HeLa细胞基因组DNA为模板,用PCR法克隆hTERT核心启动子,克隆入荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic,构建成hTERT-pGL3Basic荧光素酶报告基因重组载体。应用脂质体转染法将hTERT-pGL3Basic转染人胃癌细胞SGC7901和正常人成纤维细胞HLF,检测hTERT启动子在这两株细胞中的转录活性。2、利用基因重组技术构建hTERT启动子调控的CD:UPRT自杀基因表达载体hTERT-CD:UPRT。将hTERT-CD:UPRT和由CMV启动子调控的pcDNA3.1-CD:UPRT分别转染SGC7901细胞和HLF细胞,筛选稳定表达细胞株,用RT-PCR和Western blot方法检测CD基因的表达,用MTT法检测5-FC对转染细胞的杀伤作用及旁观者效应,用流式细胞术测定细胞凋亡率。3、用SGC7901细胞构建裸鼠胃癌皮下移植瘤模型,用脂质体包裹法局部转导hTERT-CD:UPRT,观察移植瘤的生长抑制情况。观察30天后,瘤组织做常规病理检查和免疫组化观察CD基因的表达。结果:1、成功克隆hTERT核心启动子;荧光素酶活性检测显示,hTERT启动子在SGC7901细胞中的转录活性为阳性对照pGL3-Control的（21.5±2.2）%,而在HLF细胞中的活性仅为阳性对照的（0.4±0.1）%。2、成功构建hTERT启动子调控的CD:UPRT自杀基因表达载体,转染hTERT-CD:UPRT的SGC7901细胞在mRNA和蛋白质水平均可检测到CD的表达,5-FC对其有明显的杀伤作用,流式细胞术显示细胞凋亡率明显增高;转染hTERT-CD:UPRT的HLF细胞未检测到CD的表达,5-FC对其无明显的杀伤作用。而转染pcDNA3.1-CD:UPRT的SGC7901细胞和HLF细胞在mRNA和蛋白质水平均可检测到CD的表达,5-FC对其都有明显的杀伤作用,流式细胞术显示细胞凋亡率均明显增高。旁观者效应实验显示当转染hTERT-CDUPRT的SGC7901占总细胞数的10%时,细胞存活率仅48.4%。3、动物实验表明,A组（瘤内注射hTERT-CD:UPRT+腹腔注射5-FC组）移植瘤的生长受到显著抑制,第30天肿瘤体积为（1.10±0.13）cm3,B组（瘤内注射hTERT-CD:UPRT+腹腔注射PBS组）和C组（单纯腹腔注射PBS组）的肿瘤体积分别为（2.72±0.35）cm3和（2.67±0.30）cm3。病理结果显示A组大量肿瘤细胞稀疏分散,有大片坏死红染区,部分肿瘤细胞核固缩、核碎裂;B组和C组则见大量肿瘤细胞排列紧密,细胞核大深染,核分裂像多见。免疫组化染色显示A组和B组肿瘤组织有明显CD蛋白表达;C组肿瘤组织免疫组化染色呈阴性。结论:1、hTERT启动子在人胃癌细胞SGC7901中有较强的转录活性,在端粒酶阴性的正常人成纤维细胞中仅有背景活性。2、hTERT启动子调控的CD:UPRT/5-FC融合自杀基因系统能在体内外靶向性杀伤胃癌细胞SGC7901,为胃癌的基因治疗提供了新的思路。
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标签：人端粒酶逆转录酶启动子论文; 胞嘧啶脱氨酶论文; 尿嘧啶磷酸核糖转移酶论文; 胃癌论文; 靶向基因治疗论文;