蓝狐（Alopex lagopus）微卫星位点的筛选及遗传特征的初步评价

论文摘要

蓝狐（Alopex lagopus）、银狐（Vulpes logpus）是我国重要的毛皮经济动物,其饲养历史悠久,但我国蓝银狐饲养存在谱系管理不清、近亲繁殖、遗传管理不合理等许多问题。而微卫星DNA在研究遗传多样性分析、基因组作图、QTL定位、疾病诊断与病理研究、亲缘关系鉴定及个体识别等方面发挥着巨大的作用,因此将微卫星引入到蓝银狐的饲养当中可以很好的解决以上问题。然而目前国内外对狐类动物的微卫星分离的研究很少。本文以蓝狐基因组DNA样品为材料,经Sau3 AⅠ酶切并电泳后回收300bp～900bpDNA片段,经过与生物素标记的（CA）15探针杂交,再用MagneSphere? MagneticSeparation Products磁珠（购自Promega公司）富集和PCR扩增后,构建了微卫星富集文库。利用PMD-18载体上的序列设计一条引物分别与（CA）10N、（TG）10N进行PCR反应来检测阳性克隆,并将阳性克隆送去测序。共得到55个含有微卫星的序列。筛选并选择了6个多态性较好微卫星序列,利用丙烯酰胺凝胶分析了饲养条件下蓝狐、银狐对各个位点等位基因数目、等位基因片段大小范围、等位基因频率分布、观察杂合度等指标,结果显示:6对微卫星引物的在30个蓝狐样本中平均有效等位基因数（Ne）,介于1.3245～5.7515,平均值为3.2594;期望杂合度介于0.245～0.8261之间,平均值为0.507;观望杂合度介于0.1613～0.8125之间,平均值为0.4751;多态信息含量介于0.24～0.8001之间,平均多态性信息含量为0.5115。6个微卫星位点在30个银狐样本中平均有效等位基因数（Ne）介于1～5.3248之间,平均值为2.9578;期望杂合度介于0～0.8122之间,平均值为0.5487;观望杂合度介于0～0.6之间,平均值为0.3404;多态信息含量介于0～0.7455之间,平均多态性信息含量为0.4161。通过上述诸方面的分析研究,得到以下结论:通过筛选得到的这6个微卫星位点可以作为分析蓝狐、银狐遗传多样性的研究;蓝狐的遗传多样性较好,银狐需要对种源进行改良。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 微卫星的介绍
• 1.1.1 微卫星的特点与分布
• 1.1.2 微卫星位点的多态性
• 1.2 微卫星序列的应用
• 1.2.1 遗传图谱的构建
• 1.2.2 数量性状位点（QTL）定位
• 1.2.3 标记辅助选择与谱系认证
• 1.2.4 种群遗传结构的研究
• 1.2.5 种群内个体识别
• 1.2.6 种群动态研究
• 1.2.7 遗传多样性的研究
• 1.2.8 微卫星在医学和法学中的应用
• 1.2.9 微卫星在蓝狐（Alopex lagopus）中的应用及引入到我国狐狸养殖中的意义
• 1.3 微卫星DNA的检测及分离方法的研究
• 1.3.1 微卫星DNA的检测
• 1.3.2 微卫星序列分离方法
• 1.4 本研究的内容与意义
• 1.5 本章小结
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 样品采集
• 2.1.2 试剂盒和主要药品
• 2.1.3 主要试剂的配置
• 2.1.4 主要仪器
• 2.2 微卫星的筛选
• 2.2.1 蓝狐肌肉样品DNA的提取
• 2.2.2 限制性内切酶酶切蓝狐基因组DNA及酶切片段的回收
• 2.2.3 回收目的片段与接头的连接
• 2.2.4 基因组第一次扩增
• 2.2.5 磁珠的富集
• 2.2.6 含有微卫星序列的单链DNA片段的扩增
• 2.2.7 短片段基因组文库的构建
• 2.3 测序及引物设计
• 2.3.1 测序与引物设计
• 2.3.2 引物退火温度及微卫星位点多态性的筛选
• 2.4 丙烯酰胺凝胶电泳和银染
• 2.4.1 凝胶的制备
• 2.4.2 凝胶的电泳
• 2.4.3 凝胶的银染
• 2.5 数据分析
• 2.6 本章小结
• 3 实验结果
• 3.1 微卫星的筛选
• 3.1.1 样本DNA的提取
• 3.1.2 蓝狐基因组DNASau3A Ⅰ内切酶的酶切与酶切片段的选择回收
• 3.1.3 胶回收片段连接接头后PCR扩增检测
• 3.1.4 磁珠富集目的DNA片段的PCR扩增
• 3.1.5 阳性克隆的PCR检测及测序
• 3.2 15个微卫星位点的引物设计
• 3.3 11对引物的退火温度筛选
• 3.4 丙烯酰胺凝胶电泳
• 3.5 等位基因频率
• 3.6 平均有效等位基因、期望杂合度、观望杂合度及样本平均等位基因数
• 3.7 多态信息含量
• 3.8 本章小结
• 4 讨论
• 4.1 微卫星的筛选
• 4.1.1 方法的选择
• 4.1.2 DNA的提取
• 4.1.3 酶的选择及酶切片断的选择
• 4.1.4 酶的用量及酶切时间的选择
• 4.1.5 接头与酶切片段的连接
• 4.1.6 微卫星的富集
• 4.1.7 含有微卫星序列克隆菌落的检测
• 4.2 基因型的检测方法
• 4.3 基因型的判读
• 4.4 饲养条件下蓝、银狐小群体的遗传多样性
• 4.4.1 微卫星的多样性
• 4.4.2 杂合度、多态信息含量和有效等位基因数
• 4.5 管理建议
• 4.6 研究展望
• 4.7 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢