论文题目: CdTe量子点标记靶向多肽及其介导APX模拟酶抗心肌细胞过氧化损伤研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 生物化学与分子生物学
作者: 单亚明
导师: 李惟
关键词: 量子点,信号肽,模拟酶,过氧化损伤
文献来源: 吉林大学
发表年度: 2005
论文摘要: 本论文首先设计并合成细胞核信号肽(Nuclear Targeting Sequences, NTS)和内质网信号肽(Endoplasmic reticulum Targeting Sequence, ETS)分别连接碲化镉量子点(CdTe Quantum Dots, QDs),并标记相应细胞器。实验结果表明,NTS和ETS能够有效而且准确定位于相应细胞器。鉴于清除ROS的酶类在线粒体防护体系中的重要作用,根据本研究室对抗坏血酸过氧化物酶(Ascorbate peroxidase, APX)模拟酶(DhHP-6)抗晶状体氧化损伤保护作用的研究,设计并合成了一个带有线粒体信号肽(Mitochondria Targeting Sequence, MTS)的APX模拟酶——MTS~DhHP-6(Mitochondria Targeting Sequence~Deuterohemin Histidine Peptide-6)。将模拟酶定向导入到线粒体,以使其发挥更大作用。用本研究室建立的乳鼠心肌细胞过氧化氢损伤模型,以台盼蓝染色、MTT比色、LDH漏出量及过氧化氢酶RNA表达量为指标研究MTS~DhHP-6对乳鼠心肌细胞过氧化损伤的保护作用。体外测活表明,MTS~DhHP-6具有很高的APX活性,是天然微过氧化物酶MP-11的50%;偶联QDs的MTS~DhHP-6能够有效而且准确定位于乳鼠心肌线粒体;相对于单独DhHP-6,MTS~DhHP-6能够在细胞内更有效地保护乳鼠心肌细胞避免或减少被自由基损伤。因此,MTS~DhHP-6不仅是研究抗氧化的有用工具,也具有发展成靶向APX模拟酶新药的潜在价值。本论文应用碲化镉量子点偶联穿膜肽并进入细胞定位,为刚刚兴起的QDs 对分子和细胞的标记做出了有益探索;合成MTS~DhHP-6 分子,定位于心肌细胞线粒体,表现出更有效地对过氧化损伤的保护作用,为靶向治疗药物的开发提供了有效的工具。
论文目录:
第一章 前言
第一节 信号肽研究现状
一、源于蛋白质的穿膜肽
二、人工合成的和/或嵌合的穿膜肽
三、穿膜肽的细胞内在化机制
四、小结
第二节 心肌过氧化损伤研究进展
一、过氧化损伤机理
二、过氧化损伤模型
第三节 APX 模拟酶简介
一、抗坏血酸过氧化物酶
二、过氧化物酶及其模拟物在各领域中的应用及展望
第四节 量子点荧光标记技术简介
一、量子点的最初研究
二、量子点的基本特性
三、量子点的优越性
四、量子点在生物学研究中的应用
第五节 本论文的选题及设计思路
第二章 材料和方法
第一节 信号肽及 APX 模拟酶的合成及鉴定
一、材料与试剂
(一) 材料
(二) 主要试剂的配制
二、主要仪器及设备
三、方法
(一) 合成试剂纯化
(二) 亚血红素的合成及纯化
(三) 肽的固相合成
(四) 检测合成小肽的乙酰化及生物素化效果
(五) 二硫键的合成
(六) 酶活力的测定
第二节 信号肽-量子点标记复合物的合成
一、材料与试剂
(一) 主要材料
(二) 主要试剂配制
二、主要仪器
三、方法
(一) CdTe纳米粒子的制备
(二) 标记亲合素
(三) 标记后avidin的活性检测
第三节 细胞定位标记材料和方法
一、材料和试剂
(一) 材料
(二) 主要试剂配制
二、方法
(一) 细胞的培养
(二) 细胞标记方法
第四节 乳鼠心肌过氧化氢损伤模型的制备及保护方法
一、实验材料
(一) 实验动物
(二) 主要试剂及来源
(三) 主要实验试剂配制
(四) 主要仪器
二、实验方法
(一) 原代心肌细胞培养
(二) 细胞的鉴定
(三) 过氧化损伤模型的建立及鉴定
(四) 细胞LDH 漏出量的检测
(五) 存活率的检测(台盼蓝染色方法)
(六) 细胞活力的检测
(七) REAL-TIME PCR对基因表达变化的监测
(八) DhHP-6 及 MTS~DhHP-6 对乳鼠心肌过氧化氢损伤模型的保护方法
第三章 结果和讨论
第一节 信号肽及 APX模拟酶的设计与合成
一、信号肽的设计与合成
(一) NTS的设计与合成
(二) ETS 的设计与合成
(三) MTS 的设计与合成
二、MTS~DhHP-6 的设计与合成
(一) DhHP-7 的设计
(二) DhHP-7 的合成、纯化及鉴定
(三) MTS~DhHP-6 的合成和鉴定
三、小结
第二节 细胞标记结果与讨论
一、量子点-亲和素的合成及检测
二、QDs-信号肽标记细胞
三、小结
第三节 乳鼠心肌过氧化氢损伤模型保护结果和讨论
一、乳鼠心肌过氧化氢损伤模型的建立
二、MTS~DhHP-6对乳鼠心肌细胞过氧化损伤的保护作用
三、小结
第四节 结 论
参考文献
中文摘要
英文摘要
致谢
作者简历
发布时间: 2006-01-17
参考文献
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