农杆菌介导的BcBCP1基因转化马铃薯抗旱性研究

论文摘要

本研究以马铃薯品种黄麻子的脱毒微型薯为外植体,利用农杆菌介导法将抗旱基因BcBCP1转入马铃薯中,经PCR和Southern blot检测证明BcBCP1基因已转入马铃薯基因组中。试验建立了高效的马铃薯再生体系和遗传转化体系,对影响遗传转化因素激素种类与浓度、脱菌抗生素种类与浓度、共培养时间、筛选方式等进行了研究,通过对抗性植株相对含水量、叶绿素含量,脯氨酸含量测定,初步验证转基因马铃薯植株对水分胁迫的抗性比对照有明显提高。主要研究结果如下:1薯块再生培养基确定为MS+ ZT 4 mg/L+ IAA 1mg/L,出芽率为86%。2当农杆菌菌液浓度为OD600=0.5,侵染时间为5 min时,黄麻子的出芽率最高达87.19%,此时污染率较低仅为1.2%。3共培养时间对愈伤组织诱导率影响很大,黄麻子薯块以共培养2d时转化效果最好,薯块出芽率达到了83.97%,且污染率仅为6.77%。4对不同产地脱菌抗生素的浓度进行了比较试验,国产头孢噻肟钠对BcBCP1基因的有效抑菌浓度是400mg/L,进口头孢噻肟钠对BcBCP1基因的有效抑菌浓度为150mg/L,且在有效的抑菌浓度下对外值体无不良影响。5试验采用的抗性选择剂为草丁膦（PPT）,筛选方式为延迟7d筛选,结果表明薯块芽诱导阶段PPT浓度为4mg/L,生根阶段的PPT浓度为5mg/L。6目的基因BcBCP1试验共获得72株PPT抗性植株,其中35株通过了生根筛选（PPT5mg/L）,PCR检测结果表明有14株呈阳性,进一步的Southern blot杂交检测中有6株检测有杂交信号,说明基因已经整合到马铃薯基因组中,外源基因主要是单拷贝插入。7对杂交呈阳性的转基因植株进行了生物学的检测,将6个黄麻子转基因植株及非转基因对照进行干旱胁迫处理,分析转基因植株和对照的生理指标变化情况,结果表明:在干旱胁迫处理15d后,6个黄麻子转基因植株的相对含水量与对照相比差异明显,对照植株辅氨酸含量提高了80.20%,而转基因植株叶片脯氨酸含量变异率在181.63396.28%之间;同时测定6个转基因植株与对照的叶绿素含量,结果表明对照植株叶绿素含量下降辐度为43.73%,而转基因的植株叶绿素含量下降辐度在21.98%32.62%之间。以上结果说明在干旱胁迫处理下外源BcBCP1基因在6个转基因株系均已表达,提高了马铃薯转基因植株的耐旱性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 研究目的和意义
• 1.2 文献综述
• 1.2.1 植物转基因技术研究进展
• 1.2.2 影响农杆菌介导的因素
• 1.2.3 植物耐旱基因工程研究进展
• 1.2.4 基因工程技术在马铃薯育种中的应用
• 2 材料与方法
• 2.1 材料与试剂
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株和质粒
• 2.1.3 酶和试剂
• 2.1.4 仪器设备
• 2.1.5 抗生素和激素
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 马铃薯遗传再生体系的建立
• 2.2.2 农杆菌转化外植体的方法及遗传转化体系的优化
• 2.2.3 转化再生植株的分子检测
• 2.2.4 转基因植株的生物学检测
• 3 结果与分析
• 3.1 薯块再生培养基的确定
• 3.2 遗传转化影响因素的探讨
• 3.2.1 农杆菌浓度及侵染时间对马铃薯外植体转化的影响
• 3.2.2 共培养时间对遗传转化的影响
• 3.2.3 脱菌抗生素对遗传转化的影响
• 3.2.4 芽诱导阶段选择压的确定
• 3.2.5 PPT 浓度对再生芽生根的影响
• 3.3 转基因植株的获得
• 3.4 转基因植株的分子检测
• 3.4.1 转基因植株的PCR 分析
• 3.4.2 BcBCP1 基因PCR-Southern 杂交
• 3.4.3 转基因植株的Southern 杂交分析
• 3.5 转基因植株的生物学检测
• 3.5.1 水份胁迫对叶片相对含水量的影响
• 3.5.2 水分胁迫对叶片叶绿素含量的影响
• 3.5.3 水分胁迫对叶片脯氨酸含量的影响
• 3.5.4 转基因植株与对照植株生理指标差异显著性分析
• 4 讨论
• 4.1 薯块再生培养基的确定
• 4.2 农杆菌浓度及侵染时间对遗传转化的影响
• 4.3 共培养时间对遗传转化的影响
• 4.4 脱菌剂的选择
• 4.5 转BCBCP1 基因植株的分子检测
• 4.6 BCBCP1 基因的抗旱性研究
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 图版
• 图版说明
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文