Leptin和GDNF对小鼠卵母细胞成熟的旁分泌调节机制

论文摘要

目的探讨瘦素和胶质细胞来源的神经营养因子（glial cell line-derived neurotrophicfactot,GDNF）是否有通过旁分泌机制调节卵母细胞成熟的可能。材料和方法1.DNA基因芯片分析鼠龄为21天的雌性B6D2F1小鼠,每只注射7.5单位Humegon促卵泡发育。48小时后,部分小鼠每只注射5单位Pregnyl诱发排卵。取卵巢提取RNA,然后与Affymetrix的小鼠MGU74v2芯片A,B,C杂交。2.实时荧光定量PCR检测瘦素和GDNF以及受体在hCG作用后变化情况。3.免疫组织化学研究生长因子（瘦素和GDNF）在卵巢各细胞中的表达。4.采用卵泡培养研究瘦素和GDNF对小鼠卵母细胞生殖泡破裂（germinal vesiclebreakdown,GVBD）的作用。5.对卵-卵丘复合物（COCs）和裸卵进行培养,研究瘦素和GDNF对小鼠卵母细胞第一极体释放的作用。6.采用体外成熟-采用体外受精-胚胎培养研究瘦素和GDNF对小鼠卵母细胞胞浆成熟的作用。结果1.基因芯片结果显示:hCG刺激后,小鼠卵巢瘦素的mRNA表达量变化不明显,但受体表达量显著上升。与瘦素结果不同,hCG刺激后,GDNF及其受体的表达量均明显上升。2.与基因芯片的结果基本一致,注射hCG后,瘦素的表达量改变不明显;Ob-Ra的表达量显著上升,Ob-Rb的表达量也有所上升,但不如Ob-Ra显著。GDNF及其受体Gfral的mRNA表达量均显著上升。在卵巢各细胞组分中,小鼠卵母细胞Ob-Ra的mRNA水平在注射hCG后显著上升,而Ob-Rb的mRNA水平无明显变化。小鼠卵母细胞的GDNF mRNA水平几乎检测不到。hCG作用后,卵丘细胞和壁层颗粒细胞的GDNF,Gfral和Ret mRNA水平显著上升,而卵母细胞的Gfral和Ret mRNA水平无明显变化。3.免疫组化结果:瘦素在卵细胞、卵泡膜细胞和间质细胞中呈强阳性表达;在排卵前卵泡的颗粒细胞和卵丘细胞中也呈阳性,窦前卵泡和小卵泡的颗粒细胞瘦素蛋白表达呈阴性。GDNF蛋白在排卵前卵泡的卵丘细胞、靠近卵泡腔的壁层颗粒细胞和卵泡膜细胞中表达呈阳性,小卵泡的GDNF蛋白表达呈阴性。4.体外培养条件下添加瘦素能促进小鼠卵母细胞GVBD的发生和第一极体释放,而MEK 1/2抑制剂能阻断这种促进作用。体外培养中添加GDNF能促进小鼠卵母细胞第一极体释放,但对GVBD无明显影响。5.在体外成熟培养阶段添加瘦素能促使MⅡ期卵母细胞的受精率和囊胚形成率增加。在IVM阶段添加GDNF对MⅡ期卵母细胞的受精率和囊胚形成率无明显影响。结论1)LH/hCG能使小鼠卵母细胞的Ob-Ra表达量增加。小鼠卵巢的卵丘细胞、壁层颗粒细胞和卵泡膜细胞产生瘦素。2)体外培养条件下,瘦素能促进小鼠卵母细胞GVBD的发生和第一极体的释放,而且,Ob-Ra/MEK 1/2信号传导系统参与介导了瘦素对小鼠卵母细胞核成熟的促进作用。体外成熟过程中添加瘦素能促进卵母细胞胞浆成熟。3)小鼠卵巢的卵丘细胞,壁层颗粒细胞产生GDNF,并且受到LH/hCG的调节。4)在体外培养条件下,GDNF能促进小鼠卵母细胞的第一极体释放。但对GVBD和胞浆成熟无影响。

论文目录

• 致谢
• 序言（前言）
• 摘要
• ABSTRACT
• 缩写、符号清单、术语表
• 目次
• 第一部分:促性腺激素对小鼠卵巢中瘦素和GDNF及其受体表达的调节
• 1 前言
• 2.材料与方法
• 2.1 DNA基因芯片分析
• 2.2 实时荧光定量PCR
• 2.3 免疫组织化学
• 2.4 ELISA
• 2.5 统计分析
• 3 结果
• 3.1 基因芯片结果
• 3.2 实时定量PCR和ELISA对基因芯片结果的验证
• 3.3 瘦素和GDNF在卵巢中定位的免疫组化研究
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 第二部分:瘦素对小鼠卵母细胞核成熟和胞浆成熟的促进作用
• 1 前言
• 2.材料与方法
• 2.1 动物
• 2.2 实时荧光定量PCR
• 2.3 卵泡培养
• 2.4 COCs或裸卵培养
• 2.5 体外成熟-体外受精-胚胎培养
• 2.6 统计分析
• 3 结果
• 3.1 促性腺激素对小鼠卵泡各细胞组分的瘦素以及受体mRNA表达量的调节
• 3.2 瘦素对小鼠卵母细胞核成熟的作用
• 3.3 瘦素通过MEK 1/2信号传导系统促进卵母细胞核成熟
• 3.4 瘦素对小鼠卵母细胞胞浆成熟的作用
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 第三部分:GDNF对小鼠卵母细胞第一极体释放的促进作用
• 1 前言
• 2.材料与方法
• 2.1 动物
• 2.2 实时荧光定量PCR
• 2.3 卵泡培养
• 2.4 COCs或裸卵培养
• 2.5 COCs培养以及免疫印迹
• 2.6 体外成熟-体外受精-胚胎培养
• 2.7 统计分析
• 3 结果
• 3.1 促性腺激素对小鼠卵泡各细胞组分的GDNF以及受体mRNA表达量的调节
• 3.2 GDNF对小鼠卵母细胞核成熟的作用
• 3.3 GDNF对小鼠卵母细胞胞浆成熟的作用
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 作者简历