论文摘要
磺酰脲类除草剂自问世以来由于其高效、广谱、低毒、高选择性的特性,迅速发展成为除草剂市场的主流。大部分磺酰脲除草剂在酸性环境中易水解。但是在碱性和中性的条件下部分磺酰脲除草剂具有较强的稳定性,难降解并且具有抑菌作用,通常在土壤中的半衰期达一年之久。残留在土壤中的磺酰脲除草剂不仅会对后茬敏感作物产生药害,造成经济损失,而且还会对生态环境造成严重破坏。土壤中磺酰脲类除草剂的降解方式主要有微生物降解、光解和化学水解。在中性和酸性土壤中,磺酰脲除草剂的降解主要是化学水解和微生物降解共同作用的结果。而在碱性土壤中,.微生物降解是磺酰脲除草剂降解的主要因素。由于普通的农药降解菌施到污染土壤中以后受到土壤的复杂环境和土著微生物竞争的影响,往往会影响其存活状态和修复效果。本文通过重叠延伸PCR将适合实验室培养条件发挥功能的启动子p1和土壤中发挥功能的启动子p2与磺酰脲除草剂去酯化酶基因sulE进行无缝连接,然后构建到广宿主载体pBBR1MCS-5上,将重组载体导入适合植物根际土壤中存活的恶臭假单胞菌KT2440菌株中,分别构建了基因工程菌KT-su1P1和KT-su1P2,研究了它们的降解特性,并将它们和野生型降解菌S113进行了比较。结果显示：工程菌KT-su1P1和KT-su1P2的最适温度都为30℃,最适pH都为7.0。并且KT-su1P1对噻吩磺隆的降解效果最好,能够在24 h内将50 mg/L的噻吩磺隆完全降解,对高浓度的噻吩磺隆也有较好的降解效果,能够将200 mg/L的噻吩磺隆在48 h内完全降解。在土壤实验中,分别研究了灭菌土壤和未灭菌土壤中降解菌剂接种量和农药初始浓度对噻吩磺隆的降解影响,结果表明,工程菌KT-su1P2在土壤中对噻吩磺隆的降解效果最好,在未灭菌土壤中对30mg/kg的降解率分别为73.4%。在灭菌土壤中的降解率71.7%,并且降解效果与接菌量呈正相关的关系。分别对比了S113,工程菌KT-su1P1和KT-su1P2在玉米盆钵实验中对玉米噻吩磺隆药害的解除效果,土壤中噻吩磺隆浓度为0.5、0.8、1.0,2.0 mg/kg都会对玉米幼苗的苗长和苗重,根长和根重有抑制作用,浓度越高抑制作用越强。而添加由S113,工程菌KT-su1P1和KT-su1P2制成的降解菌剂后,对噻吩磺隆药害都可以起到一定的解除作用。而工程菌KT-su1P2的解除作用最好,10 d以后,苗长和苗重,根长和根重四个指标与末加药对照相比基本恢复正常水平。由于上述构建的基因工程菌的载体pBBR1MCS-5带有抗生素抗性基因标记,这就有一定的环境风险。因此,我们尝试在不带入外源抗性基因的情况下将外源农药降解基因整合到受体菌染色体的技术,不仅能够构建适合应用于污染环境进行生物修复,而且其对生态安全的影响可以降到最低。通过PCR从pBBR1MCS-sulEp1和pBBR1MCS-sulEp2上分别扩增了带有启动子p1和p2的sulE基因,并将它连接到随机整合载体pUTTnsKm上,然后转化至E.coli DH5αλpir,再通过三亲结合的方法将目的基因整合到KT2440中,通过抗生素和蔗糖的两轮筛选,得到成功整合到染色体并无外源抗性基因的工程菌KT-puts1和KT-puts2。对工程菌生长特性和对噻吩磺隆降解的情况进行了初步研究,发现工程菌KT-puts1和KT-puts2与KT-sulEp1和KT-sulEp2相比生长趋势基本相同,但是对噻吩磺隆的降解速率要明显低于后者,可能与降解基因的拷贝数较低有关。
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标签：磺酰脲除草剂去酯化酶论文; 重叠延伸论文; 染色体无标记整合论文; 基因工程菌论文; 生物修复论文;