p38和JNK在缺氧诱导体外培养人视网膜色素上皮细胞凋亡中的作用

论文摘要

研究背景缺血缺氧是众多视网膜脉络膜疾病的关键始发因素。缺氧不仅诱导视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium, RPE）细胞的增生,而且通过影响相关细胞因子（如VEGF、PEDF等）的分泌水平间接参与了眼底新生血管性疾病的发生发展。近十年来,缺氧下RPE细胞的相关研究已逐步成为学术界热点之一。有研究表明,在多种眼底疾病中（年龄相关性黄斑变性（age related macular degeneration, AMD）、遗传性外层视网膜营养不良和增生性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreoretinopathy, PVR）等）均可观察到RPE细胞凋亡,而且部分证实了凋亡参与了疾病的发生发展。但人们对缺氧下RPE细胞凋亡的发生机制和特征却了解甚少。JNK和p38属于丝裂素活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinasea, MAPKs）家族,两者通常由紫外线、渗透压变化、细胞因子和生理激活因素所启动,又被称作MAPK应激信号通路。已有证据表明ERK通路参与了RPE细胞的增生。对于大多数细胞来说,ERK1/2和JNK、p38在对细胞凋亡的调控中作用相反。因此有理由推测p38和JNK亦可能参与了缺氧导致的RPE细胞凋亡。本研究旨在探讨JNK和p38通路在缺氧诱导的RPE凋亡中的调控作用,为临床防治缺血缺氧性眼内疾病提供实验依据。目的观察p38和JNK信号通路在缺氧诱导的体外培养人RPE细胞凋亡中可能的调控作用。方法（1）将培养的人RPE细胞置于含体积分数为1%O2、5%CO2和94%N2的培养箱内建立缺氧模型。于缺氧后1、3、6、12和24h,用光镜、扫描电镜、Annexin-V-FITC/PI染色流式细胞术（FCM）及TUNEL法检测凋亡,于缺氧后1、2、3和4d后用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测RPE细胞的增生;（2）于缺氧后1,3,6,12和24h,用Western blot检测RPE细胞内p38蛋白的表达;以及用免疫组化及免疫荧光观察p38和p-p38蛋白在RPE细胞内的定位。用p38途径抑制剂预处理RPE细胞30分钟后置于缺氧孵箱内培养3小时。Western blot检测p38信号阻断前后RPE细胞内p38蛋白的表达。（3）用p38通路抑制剂SB203580和JNK通路抑制剂SP600125预处理RPE细胞30分钟,将RPE细胞置于缺氧孵箱内培养3小时。用光镜、透射电镜、FCM及TUNEL法检测对细胞凋亡的影响;用MTT比色法检测抑制剂对细胞增生的影响。结果（1）缺氧可致RPE细胞凋亡,凋亡细胞数随缺氧时间延长而增加（ P< 0. 01）,在3小时达高峰;MTT显示,缺氧处理后的RPE细胞增生较快,缺氧后2、3和4d时,缺氧组较对照组A值显著增大（P< 0.01）;（2） Western blot显示缺氧1、3、6、12和24h时,均有磷酸化p38蛋白表达,3h水平最高,持续至24h。经p38抑制剂处理后细胞中磷酸化p38蛋白水平降低,表明SB203580能有效抑制p38的磷酸化;免疫组化显示,常氧状态下p38蛋白在RPE细胞胞浆和胞核中均有分布。缺氧后,细胞浆内棕色强度减弱,胞核颜色明显加深,提示p38蛋白由胞浆向胞核内转位。免疫荧光证实,常氧条件下p-p38蛋白荧光仅在RPE细胞胞浆内有微量表达,胞核内无表达。随缺氧时间的延长,p38蛋白的磷酸化水平逐渐增高,细胞核荧光强度明显增强,至3h表达最强,24h开始下降。（3）缺氧3小时时RPE细胞凋亡明显;经p38和JNK抑制剂处理的细胞凋亡水平明显下降（P < 0.01）;MTT未显示抑制剂对细胞增生有影响（P > 0.05）。结论缺氧不仅能诱导RPE细胞增生,亦能诱导凋亡。p38和JNK转导通路参与了缺氧诱导人RPE细胞的凋亡。通过本课题的初步研究,有理由推测缺氧通过激活p38和JNK转导途径调控体外培养的人RPE细胞的凋亡。本研究为下一步通过信号转导通路调控缺氧下RPE凋亡提供了试验证据,亦为临床防治缺血缺氧性眼内疾病提供了新思路。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 文献回顾
• 正文 P38和JNK在缺氧诱导体外培养人视网膜色素上皮细胞凋亡中的作用
• 1 引言
• 2 主要材料、试剂和仪器
• 3 研究方法
• 3.1 RPE细胞的复苏培养
• 3.2 缺氧对人RPE细胞增生和凋亡的影响
• 3.2.1 MTT法检测缺氧对人RPE细胞增生的影响
• 3.2.2 光镜观察缺氧对人RPE细胞的影响
• 3.2.3 扫描电镜检测缺氧对人RPE细胞凋亡的影响
• 3.2.4 透射电镜检测缺氧 3 小时对人 RPE 细胞凋亡的影响
• 3.2.5 流式细胞仪测凋亡
• 3.2.6 TUNEL染色测凋亡
• 3.3 缺氧对人RPE细胞中p38 的激活和表达的影响
• 3.3.1 Western blot 检测人RPE细胞内p38 及磷酸化p38 的表达
• 3.3.2 免疫组化染色检测人RPE细胞p38 的定位
• 3.3.3 免疫荧光染色法检测人RPE细胞磷酸化p38 的定位
• 3.4 抑制p38 和JNK信号通路对缺氧诱导RPE细胞凋亡的影响
• 3.4.1 MTT法筛选p38 及JNK激酶抑制剂的适宜浓度
• 3.4.2 流式细胞仪检测 SB203580 及 SP600125 处理后对缺氧诱导 RPE 细胞凋亡的影响
• 3.4.3 TUNEL 染色法测 SB203580 及 SP600125 处理后对缺氧诱导 RPE 细胞凋亡的影响
• 4 结果
• 4.1 缺氧对人RPE细胞增生和凋亡的影响
• 4.1.1 缺氧对人RPE细胞增生的影响
• 4.1.2 光镜观察缺氧对人RPE细胞形态的影响
• 4.1.3 扫描电镜检测缺氧对人RPE细胞凋亡的影响
• 4.1.4 透射电镜检测缺氧 3 小时对人 RPE 细胞凋亡的影响
• 4.1.5 流式细胞仪检测缺氧对人RPE细胞凋亡的影响
• 4.1.6 TUNEL染色检测缺氧对人RPE细胞凋亡的影响
• 4.2 缺氧对人RPE细胞p38 的激活和表达的影响
• 4.2.1 缺氧对人RPE细胞中p38 及磷酸化p38 的表达的影响
• 4.2.2 缺氧时人RPE细胞中p38 及磷酸化p38 的定位
• 4.3 抑制p38 和JNK信号通路对缺氧诱导RPE细胞凋亡的影响
• 4.3.1 SB203580 及 SP600125 处理对人 RPE 细胞增生的影响
• 4.3.2 流式细胞仪检测 SB203580 及 SP600125 处理对缺氧诱导 RPE 细胞凋亡的影响
• 4.3.3 TUNEL 染色法检测 SB203580 及 SP600125 处理对缺氧诱导 RPE 细胞凋亡的影响
• 5 讨论
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 个人简历和研究成果
• 致谢