两种斑蝥素人工抗原的合成及其多克隆抗体制备研究

论文摘要

斑蝥素是芫菁体内的一种单萜类化合物,对多种靶标生物具有明显的毒杀和拒食作用,但斑蝥素在虫体内的作用靶标尚不明确。为此,本研究设计合成了斑蝥素半抗原、人工抗原,并免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,以期为通过酶联免疫分析寻找斑蝥素的作用靶标和深入研究斑蝥素对试虫的毒理提供重要的方法基础。主要结果如下:1.设计合成了斑蝥素的半抗原N-羧甲基斑蝥酰亚胺（BG）和N-羟乙基斑蝥酰亚胺（BY）。BY进一步经琥珀酸酐法合成琥珀酸酯（BYS）。经MS、NMR、IR、TLC、熔点测定法对其结构及纯度进行了鉴定,其结果表明成功合成半抗原。2.采用混合酸酐法和碳二亚胺法将半抗原与载体蛋白BSA、OVA偶联合成了斑蝥素的人工免疫抗原和包被抗原（BG-HS-BSA、BYS-HS-BSA、BG-TY-BSA、BYS-TY-BSA、BG-HS-OVA、BYS-HS-OVA、BG-TY-OVA、BYS-TY-OVA）并经MS、IR法对人工抗原进行定性鉴定,其表明成功合成人工抗原。3.通过用免疫原BYS-HS-BSA、BYS-TY-BSA、BG-HS-BSA、BG-TY-BSA免疫动物获得多克隆抗体,获得的抗体BYS-HS-Ab、BYS-TY-Ab、BG-TY-Ab、BG-HS-Ab效价分别为8000、16000、1.28×105、300,因此采用BG-TY-Ab抗体进行后续试验。4.建立斑蝥素酶联免疫分析方法,以包被抗原BG-TY-OVA和抗体BG-TY-Ab组合建立的N-羧甲基斑蝥酰亚胺IC-ELISA检测方法,测定N-羧甲基斑蝥酰亚胺对BG-TY-Ab与BG-TY-OVA组合的IC50为215μg/mL,IC10为3.156μg/mL,线性检测范围为3.125～625μg/mL,R2=0.9818。实验结果表明经N-羧甲基斑蝥酰亚胺制备的抗体对N-羧甲基斑蝥酰亚胺检测具有很好的特异性和灵敏性。本研究通过混合酸酐法和碳二亚胺法合成斑蝥素人工抗原,对于斑蝥素类似物新的检测方法进行了探索,对于合成的半抗原N-羧甲基斑蝥酰亚胺的检测有较好的检测效果,为后续斑蝥素酶联免疫方法的建立提供了科学依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 斑蝥素研究概况
• 1.1.1 斑蝥素的结构与性质
• 1.1.2 斑蝥素的提取和鉴定
• 1.1.3 斑蝥素及其类似物的合成
• 1.1.4 斑蝥素人工抗原合成研究现状
• 1.2 农药免疫分析技术
• 1.2.1 抗原的制备
• 1.2.2 半抗原、人工抗原的鉴定
• 1.2.3 免疫血清、抗体的制备及应用
• 1.2.4 农药免疫分析技术的应用
• 1.2.5 农药免疫分析技术的展望
• 1.3 本论文的设计思路
• 1.4 本研究的技术路线
• 第二章 斑蝥素半抗原、人工抗原的合成及鉴定
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 试剂和试材
• 2.1.2 主要试验仪器
• 2.1.3 试验方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 化合物BG
• 2.2.2 化合物BY
• 2.2.3 BYS 检测
• 2.2.4 人工抗原鉴定
• 2.3 讨论
• 2.3.1 斑蝥素半抗原设计思路
• 2.3.2 人工抗原合成方法及鉴定方法
• 第三章 斑蝥素多克隆抗体的制备
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 试剂和试材
• 3.1.2 试验仪器
• 3.1.3 斑蝥素多克隆抗体的制备
• 3.1.4 血液采集及抗血清的分离
• 3.1.5 抗体的鉴定，抗血清的筛选
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 抗血清的筛选结果
• 3.2.2 抗原抗体最适工作浓度的确定
• 3.3 讨论
• 第四章 斑蝥素IC-ELISA 方法的建立
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 试剂和试材
• 4.1.2 试验仪器
• 4.1.3 IC-ELISA 方法的建立
• 4.1.4 IC-ELISA 分析条件的优化
• 4.1.5 IC-ELISA 方法特异性检测
• 4.1.6 IC-ELISA 方法的灵敏性检测
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 IC-ELISA 分析条件优化结果
• 4.2.2 IC-ELISA 方法特异性检测
• 4.2.3 IC-ELISA 方法的灵敏性检测
• 4.3 讨论
• 第五章 总结与讨论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介