论文题目: 核孔蛋白p62促进非受体型酪氨酸激酶c-Ab1进入细胞核
论文类型: 博士论文
论文专业: 分子遗传学
作者: 黄维
导师: 刘传暄,曹诚
关键词: 核孔蛋白,细胞核细胞质转运
文献来源: 中国人民解放军军事医学科学院
发表年度: 2005
论文摘要: 非受体酪氨酸激酶c-Abl广泛表达于各组织细胞中,其序列高度保守。它的亚细胞定位与其功能密切相关。细胞核内的c-Abl在细胞凋亡调控以及DNA损伤修复过程中起重要作用,而胞质中的c-Abl则与细胞黏附、细胞分化和氧化应激有关。c-Abl借助其C端的3个核定位信号(NLS)和一个核输出信号(NES)完成细胞核-细胞质间的穿梭过程。与此形成鲜明对照的是,具有恶性转化能力的c-Abl突变体都只定位于细胞质中。例如BCR-Abl,虽然它具有与c-Abl相同的C端序列和NLS、NES,但它只存在于胞质中,而且胞质中BCR-Abl的组成型活化是导致人类慢性粒细胞白血病(CML)的重要原因。目前,关于c-Abl核-质穿梭的详细机制还不清楚。 通过酵母双杂交系统,以人类Ib型c-Abl作为诱饵蛋白,进行Hela细胞cDNA文库的筛选。获得了一个可能在c-AM核-质穿梭过程中具有调控作用的蛋白:核孔蛋白p62。核孔复合物(NPC)是大分子物质进行核.质运输的唯一通道,p62是NPC的一个重要组成部分,它位于中央通道内侧,在许多物质的核-质穿梭过程中具有调节作用。通过免疫共沉淀和体外结合实验证实:c-Ab1和p62之间具有相互作用,而且这种相互作用是通过c-Ab1的SH3结构域与p62的P299位点之间的结合实现的;p62可被c-Ab1部分磷酸化;在电离辐射和阿糖胞苷所致的DNA损伤的研究中发现,c-Ab1与p62及其二聚体的结合在DNA损伤早期呈增多的趋势,在DNA损伤后期,二者之间的结合减少;此外,通过亚细胞组分的分离和激光共聚焦显微镜观察,发现p62具有促进c—Ab1进入细胞核的作用。
论文目录:
缩略词表
摘要
ABSTRACT
前言
一.非受体酪氨酸激酶c-Abl的结构与功能
1.c-Abl的结构特点
1.1 c-Abl的N端
1.2 c-Abl的C端
2.c-Abl激酶活性的调控
3.c-Abl的亚细胞定位与其功能的关系
3.1 c-Abl在细胞核中的作用
3.2 c-Abl在细胞质中的作用
3.3 c-Abl的细胞核-细胞质穿梭过程
二.大分子物质的跨核膜转运的途径及其调控
三.筛选相互作用蛋白的重要工具——酵母双杂交系统
材料与方法
1.酵母双杂交用菌株、质粒、培养基及其他试剂
2.酵母双杂交方法
2.1 酵母感受态细胞的制备
2.2 小规模酵母转化
2.3 β-gal分析
2.4 酵母(BD质粒)感受态的制备
2.5 大规模转化文库质粒DNA
2.6 阳性克隆的筛选及酵母质粒的提取
2.7 AD质粒的PCR鉴定、测序及转化
2.8 阳性AD质粒的再次验证
3.其它实验用菌株、细胞株及质粒
4.分子生物学工具酶
5.载体构建、引物合成及测序
5.1 Flag-p62及其突变体的构建
5.2 Myc-p62及其突变体的构建
5.3 GST-p62及其突变体的构建
5.4 DsRed-p62表达载体的构建
6.谷胱甘肽S转移酶(glutathion S-transferase，GST)融合蛋白的制备
7.转染质粒的制备
8.细胞培养与转染
9.免疫沉淀(Immunoprecipitation，IP)与免疫印迹(Immunoblot，IB)
10.体外激酶分析实验
11.细胞核、细胞质蛋白的分离
12.活体细胞的荧光共聚焦显微镜观察
结果
1.通过酵母双杂交实验获得与c-Abl相互作用的蛋白：核孔蛋白p62
2.p62在体内外均与c-Abl相互作用
3.p62可被c-Abl磷酸化
4.p62可促进c-Abl进入细胞核
5.DNA损伤处理后p62与c-Abl之间相互作用的变化
讨论
1.通过酵母双杂交实验获得可能参与c-Abl核-质穿梭过程的相互作用蛋白：核孔蛋白p62
2.非受体酪氨酸激酶c-Abl与核孔蛋白p62之间的相互作用
3.c-Abl对p62的磷酸化作用
4.p62对c-Abl进入细胞核的影响
5.DNA损伤对c-Abl和p62相互作用的影响
6.小结
参考文献
附录
致谢
文献综述
已接受论文
博士期间已发表论文目录
发布时间: 2005-09-05
参考文献
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