嗜热古菌硫矿硫化叶菌中小热激蛋白基因的克隆、表达和性质研究

论文摘要

小分子量热激蛋白广泛存在于古细菌和真核生物细胞中,它们能够在体内外促进蛋白质多肽链的正确折叠,有效地抑制变性蛋白质的聚集,具有重要的作用。硫矿硫化叶菌（Sulfolobus solfataricus）是一种典型的泉古菌门硫化叶菌属嗜热古菌,具有良好的耐高温性能,虽然其基因组序列已经测定并发表,SsHsp14.1的全序列已经可以在Genbank数据库中得到,但是,关于该基因的功能的描述还是模糊的,关于这个sHsp的研究在国际上未见报道,本实验室首次克隆表达了该菌的sHsp基因,并进行了性质研究。本研究将SsHsp14.1基因克隆到原核表达载体pET-28a（+）中,构建了重组融合表达质粒pSEPHLK1,转化至E.coli BL21（DE3）中,用IPTG诱导,优化表达条件,并分离纯化了重组融合蛋白。结果表明:首次成功利用大肠杆菌表达体系表达出SsHsp14.1蛋白,表达的蛋白分子量约17kDa。优化出的表达条件:1.0mM IPTG、37oC诱导8h后,表达的目的蛋白大部分可溶。利用重组蛋白N-末端的组氨酸标签,通过Ni2+柱亲和层析和SephadexG50凝胶层析纯化后,最终我们获得了纯度达90%以上的重组目的蛋白蛋白性质研究表明,体内表达重组SsHsp14.1可以提高大肠杆菌菌体内蛋白的热稳定性,阻止了部分蛋白遇热聚集沉降,进而提高大肠杆菌菌体的耐热性。也许改善了细胞膜的稳定性,从而增加了细菌细胞的活力;重组SsHsp14.1在体外具有分子伴侣活性,不仅体现在对胰岛素B链在DTT还原时的聚集的抑制,而且在60°C下阻止了这种CALB（Candida antarctica lipase B）酶蛋白的受热变性后的聚集沉降,也表明了这种sHsp可以单独对加热下有聚集沉降倾向的蛋白提供保护而不需要辅助蛋白;重组目的蛋白可以提高部分酶的热稳定性,我们选择的是菠萝蛋白酶和限制性内切酶EcoR I作为作用底物,也说明了目的蛋白作用底物的多样性。另外,重组SsHsp14.1本身具有很好的热稳定性,不仅在80°C下4h后仍处在可溶状态,而且纯化后的该蛋白还具有体外的分子伴侣活性,即阻止其他蛋白的遇热变性沉淀。这一特性也许和硫矿硫化叶菌这一嗜热古菌的耐高温性有关,而且启发了对该蛋白纯化的简化思路。一系列的性质研究为进一步了解嗜热古菌sHsp的作用特点和机制奠定了良好的基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 热激蛋白简介
• 1.2 小分子量热激蛋白的概念和特点
• 1.2.1 sHsps 的概念
• 1.2.2 sHsps 的多样性
• 1.2.3 sHsps 基因的结构特征
• 1.2.4 sHsps 的结构特征
• 1.3 小分子量热激蛋白的生物学功能
• 1.3.1 sHsps 的分子伴侣活性
• 1.3.2 sHsps 的作用特点
• 1.4 小分子量热激蛋白的作用机理
• 1.5 小分子量热激蛋白的应用
• 1.5.1 提高细胞内或周质空间内蛋白的表达量
• 1.5.2 帮助蛋白质重折叠
• 1.5.3 抑制蛋白降解作用
• 1.5.4 提高生物芯片中蛋白和多肽的稳定性
• 1.6 嗜热古菌和sHsps
• 1.7 嗜热古菌Sulfolobus solfataricus
• 1.8 本文的研究背景与设计思路
• 第二章 硫矿硫化叶菌中小热激蛋白基因的克隆
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料与方法
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 实验方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 SsHsp14.1 基因的PCR 扩增
• 2.3.2 重组质粒的构建
• 2.3.3 重组质粒的转化与鉴定
• 2.3.4 SsHsp14.1 基因的序列分析
• 2.4 本章小结
• 第三章 重组SsHsp14.1 的优化表达与纯化
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料与方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 实验方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 目的蛋白的诱导表达
• 3.3.2 IPTG 诱导浓度的优化表达
• 3.3.3 诱导时间的优化表达
• 3.3.4 诱导温度的优化表达
• 3.3.5 目的蛋白的纯化
• 3.4 小结
• 第四章 重组SsHSP14.1 的性质研究
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料与方法
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 实验方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 在体内表达重组目的蛋白提高了E. coli 蛋白的热稳定性
• 4.3.2 体内表达重组目的蛋白对E. coli 热存活性有保护作用
• 4.3.3 重组SsHsp14.1 在体外具有分子伴侣活性
• 4.3.4 重组目的蛋白可以提高部分酶的热稳定性
• 4.3.5 对重组SsHsp14.1 自身热稳定性的探讨
• 4.4 小结
• 第五章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 创新点
• 5.3 展望
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间取得的研究成果
• 致谢