论文摘要
背景及目的腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase,AMPK）是细胞能量调节的感受器。研究资料表明,AMPK激活剂二甲双胍及AICAR可对多种肿瘤细胞产生增殖抑制作用,其功能与AMPK对细胞周期调控作用密切相关。目前有关AMPK激活剂对肝癌细胞增殖抑制、细胞周期影响的报道较少,未见详细机制的报道。本研究将通过AMPK激活剂二甲双胍及AICAR对肝癌细胞株HepG2的增殖抑制、细胞周期影响及其作用机制的研究,为AMPK成为抗肿瘤治疗的新靶点提供新的理论依据。材料和方法1.用含10%胎牛血清,100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的RPMI-1640培养基培养人肝癌细胞株HepG2细胞。2.用含不同浓度二甲双胍（2.5、5.0、10、20mM）,AICAR（50、100、250、500μM）的培养基分别处理HepG2细胞24、48、72h,以未予药物处理细胞为对照,噻唑蓝比色法（MTT法）检测二甲双胍及AICAR对HepG2细胞增殖的影响。3. HepG2细胞用含10mM的二甲双胍的培养基和500μM的AICAR的培养基作用72h,经碘化丙啶（PI）单染法,用流式细胞分析仪（FCM）检测HepG2细胞周期情况。4.用含10mM的二甲双胍培养基和500μM的AICAR的培养基作用HepG2细胞24h,Western Blot检测AMPK磷酸化程度、以及G1/S调节点细胞周期调节蛋白p21CIP、p27KIP、cyclin D1、CDC2、CDK2表达量。5. HepG2细胞用含10mM的二甲双胍的培养基和500μM的AICAR的培养基作用24h ,DAPI染色后荧光显微镜下观察HepG2细胞凋亡情况。结果1. Western blot结果显示,经二甲双胍及AICAR处理后,HepG2细胞AMPK磷酸化程度较对照组增强。2. MTT法检测结果显示,与对照组比较,二甲双胍及AICAR能抑制HepG2细胞的生长,并且呈浓度和时间依赖性。3.流式细胞术检测结果显示,HepG2细胞经二甲双胍及AICAR处理24h后,细胞周期发生G0-G1期停滞,G0-G1期百分比和对照组相比较,差别具有统计学意义。4. Western Blot结果显示,经二甲双胍及AICAR处理后,HepG2细胞p21CIP和p27KIP表达较对照组增强,cyclin D1表达较对照组减弱, CDK2、CDC2表达与对照组比较无明显变化。5. DAPI染色观察可见,HepG2细胞经二甲双胍及AICAR处理24h后,镜下可见部分细胞核碎裂,细胞发生凋亡。结论1. AMPK激活剂诱导HepG2细胞增殖抑制。2. AMPK激活剂诱导HepG2细胞发生G0-G1期细胞周期停滞。3. AMPK激活剂磷酸化激活HepG2细胞AMPK,上调p21CIP、p27KIP表达量,下调cyclinD1表达量,CDC2、CDK2表达量无明显变化。4. AMPK激活剂诱导HepG2细胞凋亡。综上所述,AMPK激活剂通过磷酸化激活AMPK,上调p21CIP、p27KIP表达,下调cyclinD1表达,抑制G1/S检查点,诱导肝癌细胞发生G0-G1期细胞周期停滞。
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