玉米WRKY基因启动子的克隆与功能分析

论文摘要

启动子是基因表达调控重要的元件，启动子的活性间接反映了它所控制的基因表达。组织特异性启动子作为启动子的一种，可以启动外源基因在受体植物的特定组织器官中高效表达，减少不必要的浪费。WRKY基因家族是在植物中起特异作用的一类转录调控因子，它被证明了参与植物的抗病反应，还影响植物的衰老、抗胁迫以及生长和发育。本实验克隆了一个玉米WRKY基因的启动子，采用GUS报告基因对WRKY基因的启动子功能进行了分析，通过启动子的删减实验，水稻的遗传转化及组织的GUS染色，取得如下结果：1、根据网上预测的WRKY基因设计引物，从玉米(玉米品种B73)中扩增了该基因的启动子部分，命名为P2880，在启动子顺式作用元件预测网站上分析该启动子序列，预测到存在TATA盒、CAAT盒和GATA盒等多个作用元件。2、克隆出WRKY基因上游的启动子并且克隆了4个5’端缺失启动子，5个启动子的长度依次为2880bp、1812bp、1254bp、680bp和355bp。将5个启动子与含有GUS报告基因的质粒pCAMBIA1301连接并构建了pCAM2880GUS和4个5’端缺失启动子载体，将缺失载体分别命名为pCAM1812GUS、pCAM1254GUS、pCAM680GUS和pCAM355GUS。3、用农杆菌介导法将所有植物表达载体转化水稻，获得了37棵转基因植株。由实验结果可知，pCAM2880GUS载体对应的转基因植株愈伤组织染色结果为蓝色，而pCAM1812GUS、pCAM1254GUS、pCAM680GUS、pCAM355GUS载体对应的转基因植株的愈伤组织均未染上蓝色，由此可知P2880启动子的核心区域位于转录起始位点前2880bp至1812bp之间。综上所述，本研究克隆了一个玉米WRKY基因启动子，并发现该启动子是一个愈伤特异性启动子，而目前WRKY基因未有愈伤组织表达特异性的报道，该启动子的克隆对玉米相关基因功能研究具有重要的意义。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 1 文献综述
• 1.1 植物启动子概述
• 1.1.1 启动子的概念
• 1.1.2 启动子的结构
• 1.1.3 植物启动子的分类
• 1.2 启动子分析的方法
• 1.2.1 TRANSAFC数据库（http:/trnasfae.gbf.de/TRANSAFC）
• 1.2.2 PLACE数据库（http://dna.affre.go.jp/sigsean/）
• 1.2.3 PlantCARE数据库（http://sphinx.rug.ae.be:8080/PlantCARE/）
• 1.3 启动子克隆的方法
• 1.3.1 探针载体筛选启动子
• 1.3.2 普通PCR克隆启动子
• 1.3.3 以PCR技术为基础的技术克隆启动子
• 1.4 植物遗传转化法
• 1.5 本课题研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 技术路线
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 植物材料
• 2.2.2 菌株与质粒
• 2.2.3 转化受体材料与外植体培养
• 2.2.4 培养基
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 CTAB法提取玉米基因组总DNA
• 2.3.2 PCR克隆启动子序列
• 2.3.3 PLACE分析
• 2.3.4 质粒的重组与转化
• 2.3.5 转基因水稻的获得
• 2.3.6 转基因植株的PCR分析
• 2.3.7 GUS活性检测
• 3 结果与分析
• 3.1 启动子的克隆与序列分析
• 3.1.1 启动子的克隆和生物信息学分析
• 3.2 载体构建
• 3.3 水稻的遗传转化及转基因植株的检测
• 3.3.1 水稻的遗传转化
• 3.3.2 转基因植株的PCR检测
• 3.4 GUS染色结果与分析
• 4 讨论
• 4.1 计算机数据分析与生物实验结合的方法具有可行性
• 4.2 Zm2880启动子是一个愈伤特异性启动子
• 4.3 Zm2880启动子的核心区域
• 5 小结
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 攻读硕士学位期间发表的论文