基因重组大肠杆菌的发酵及其降血压肽制取技术研究

论文摘要

高血压是一种高发病率、多并发症的危险疾病，正严重危害着人类身体健康和生活质量。降血压肽（AHP）是一类能够降低人体血压的多肽的总称，它是血管紧张素转化酶（ACE）的抑制剂，可通过抑制人体血管紧张素Ⅱ的生成而达到降低血压的目的。降血压肽毒副作用低、降压效果明显、来源广泛，已成为目前研究的热点。目前降血压肽的制备主要采用酶解法，但由于特异性蛋白酶筛选繁琐、分离纯化工艺复杂、产量低等问题而无法实现产业化。利用基因工程技术生产降血压肽是克服上述困难进行大规模生产的重要途径，有广阔应用前景。本研究在已构建的重组降血压肽基因表达系统的基础上，通过生产原料国产化、高密度发酵工艺优化及分离纯化工艺优化等研究，以克服原料成本和分离纯化成本高等重组降血压肽产业化生产的问题，为工业化生产打下了基础。主要研究内容和结果如下：1、采用正交设计对工程菌的培养基配方及融合蛋白GST-AHP的表达条件进行优化。得到最佳国产发酵培养基配方为：酵母粉3％，蛋白胨2.5％，葡萄糖1％，NaC10.5％；最佳培养及诱导条件：温度37℃，起始pH 7.0，装液量20％（v／v），接种量2％（v／v），培养至OD600值1.5，加入IPTG至终浓度0.5mmol／L，诱导4 h。2、发现不含葡萄糖的国产培养基能够利用乳糖诱导剂诱导表达产生GST融合蛋白，经优化得到的乳糖诱导剂诱导温度为30℃，起始OD值为2.5，乳糖终浓度为2％，诱导时间为8h。最终GST蛋白的表达量比用IPTG为诱导剂提高了38％。3、重点探讨了溶氧和补料两个因素对高密度发酵的影响。最终确定在高密度发酵中溶氧为40％，发酵开始2h开始补料，补料速度为1 mL／min，补料时间为1h。在此条件下菌体密度最大可以达到200，符合工业化生产要求。4、对目标降血压多肽的分离和纯化进行了研究。采用截流分子量为100kDa和10kDa的超滤膜对GST蛋白进行了纯化，目标蛋白的透过率为47.4％。研究还发现胰蛋白酶可以替代价格昂贵的凝血酶完全酶切GST蛋白，酶切温度为37℃、酶用量为4000U／g、作用时间0.5h。继用脱羧酶作用酶解液后，用高效液相色谱法测定目标多肽的含量，得到了降血压肽段VLPVP，含量为29.8ug／mL。

论文目录

• 目录
• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩略词表
• 第一章 绪论
• 1.1 高血压概述
• 1.1.1 高血压及其危害
• 1.1.2 高血压的发病机制及治疗方法
• 1.1.3 肾素-血管紧张素系统、激肽释放酶-激肽系统与高血压
• 1.2 降血压肽的研究进展
• 1.2.1 降血压肽的研究现状
• 1.2.2 降血压肽降血压机理的研究
• 1.2.3 降血压肽的制备方法
• 1.2.4 我国食品降血压肽研究中存在的问题及前景分析
• 1.3 本研究的学术背景及理论与实践意义
• 1.4 本课题的来源及主要研究内容
• 第二章 工程菌培养基国产化的研究
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 培养基和常用溶液配制
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 C源单因素实验
• 2.2.2 N源单因素实验
• 2.2.3 C、N源正交实验
• 2.2.4 培养条件优化
• 2.2.5 生长曲线测定
• 2.2.6 IPTG诱导条件优化
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 C源单因素实验
• 2.3.2 N源单因素实验
• 2.3.3 C、N源正交实验
• 2.3.4 工程菌培养条件优化结果
• 2.3.5 生长曲线测定
• 2.3.6 工程菌诱导条件优化结果
• 2.4 本章小结
• 第三章 乳糖做为诱导剂替代IPTG的研究
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 菌株
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 培养基和常用溶液配制
• 3.1.4 主要仪器设备
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 乳糖诱导浓度单因素实验（含葡萄糖培养基）
• 3.2.2 加葡萄糖培养基与不加葡萄糖培养基诱导比较
• 3.2.3 乳糖诱导浓度单因素实验（不含葡萄糖培养基）
• 3.2.4 乳糖诱导正交实验
• 3.2.5 诱导综合比较
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 乳糖诱导浓度单因素实验（含葡萄糖培养基）
• 3.3.2 加葡萄糖培养基与不加葡萄糖培养基诱导比较
• 3.3.3 乳糖诱导浓度单因素实验（不含葡萄糖培养基）
• 3.3.4 乳糖诱导正交实验
• 3.3.5 诱导综合比较
• 3.4 本章小结
• 第四章 重组降血压肽高密度发酵工艺研究
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 菌株
• 4.1.2 主要试剂
• 4.1.3 培养基和常用溶液配制
• 4.1.4 主要仪器设备
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 5L发酵罐中工程菌生长曲线的测定
• 4.2.2 10%-80%不同的溶氧对蛋白表达量的影响
• 4.2.3 发酵过程中发酵液含氮量的变化
• 4.2.4 诱导前补料方案的研究
• 4.2.5 诱导后补料方案的研究
• 4.2.6 补料因素综合比较
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 5L发酵罐中工程菌生长曲线的测定
• 4.3.2 10%-80%不同的溶氧对蛋白表达量的影响
• 4.3.3 发酵过程中发酵液含氮量的变化
• 4.3.4 诱导前补料方案的研究
• 4.3.5 诱导后补料方案的研究
• 4.3.6 补料因素综合比较
• 4.4 本章小结
• 第五章 重组降血压肽分离纯化工艺研究
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 菌株
• 5.1.2 主要试剂
• 5.1.3 培养基和常用溶液配制
• 5.1.4 主要仪器设备
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 超滤分离目标蛋白条件的优化
• 5.2.2 胰蛋白酶酶解蛋白条件的优化
• 5.2.3 RP-HPLC检验酶解产物
• 5.2.4 降血压肽ACE抑制活性的测定
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 超滤分离目标蛋白条件的优化结果
• 5.3.2 胰蛋白酶酶解GST蛋白条件的优化结果
• 5.3.3 RP-HPLC检验酶解产物的结果
• 5.3.4 降血压肽的抑制率和IC50
• 5.4 本章小结
• 结论与展望
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表论文情况
• 致谢