新肿瘤标志物的筛选及功能初步研究

论文摘要

第一章肿瘤标志物的生物信息学筛选及其表达谱初步分析目的:采用生物信息学方法筛选肿瘤差异表达基因,并对筛选得到的结果进行表达谱初步分析。方法:利用CGAP网站提供的cDNA xProfiler工具,以人类正常组织和肿瘤组织EST数据库为基础,筛选肿瘤差异表达基因,并对筛选得到的68个基因进行染色体定位。采用电子杂交以及RT-PCR的方法对筛选得到的结果进行表达谱初步分析。结果:通过生物信息学筛选得到在肿瘤组织中特异性表达的基因或EST片段2801个,其中已知基因68个,未知基因2733个。在这68个已知基因中,40个基因的功能已基本明确。在这40个基因中5个基因已经实验证实为肿瘤特异性基因,占12.5%。对筛选得到的68个基因进行染色体定位,发现在7号和10号染色体上筛选得到的肿瘤特异性基因较少,而在8号、21号以及X染色体中肿瘤特异性基因出现的频率明显多于其他染色体。进一步对筛选得到的2801个肿瘤特异性表达基因或EST片段进行电子杂交分析,9个基因结果较理想。RT-PCR检测这9个基因在不同细胞株中的表达,7个基因在被检测的11个细胞株中未得到目的片段,而GABRA3基因与HTA基因在肿瘤细胞中表达特异。结论:生物信息学筛选肿瘤差异表达基因是一种高效的方法。肿瘤特异性基因在某些染色体上相对“活跃”。第二章GABRA3基因的表达谱分析及功能研究目的:对GABRA3基因进行表达谱分析及功能初步研究。检测GABAA受体各亚单位在肿瘤组织中的表达。方法:采用RT-PCR以及免疫组化法分析GABRA3的表达谱。通过RNAi以及药物处理对GABRA3基因的功能进行初步研究。结果:在被检测的11株细胞株中,GABRA3基因在肝癌细胞株HepG2,乳腺癌细胞株MCF-7,MDA-MB-231和胶质瘤细胞株U251中表达,而在其他肿瘤细胞株以及正常细胞株中无表达。在被检测的20种正常组织中,该基因除在脑组织,子宫内膜,胎盘以及前列腺中有表达外,在其他正常组织中均未被检测到。在18例新鲜肺癌组织标本中GABRA3表达阳性率为66.67%,而对应的18例肺癌癌旁组织中均未检测到该基因。采用免疫组化的方法,分析GABRA3在60例肺癌及10例癌旁组织中的表达。10例癌旁组织均未染色,而60例肺癌组织标本中GABRA3蛋白表达的阳性率为41.67%,肺癌组织中细胞阳性染色主要见于胞质和胞膜。通过对GABRA3蛋白在肺癌组织中表达量与临床资料的相关性分析,发现GABRA3蛋白的表达量肺癌的病理分级密切相关（p＜0.05）。随着肿瘤恶性程度的增高,GABRA3蛋白表达的阳性率和表达量有增高的趋势。在8例肝癌组织标本中,共6例表达GABRA3基因,阳性率为65%。而在所有对应的癌旁组织中均未扩增得到该基因目的片断。在肺癌和肝癌组织中,还检测了GABAA受体其他亚单位的表达情况,除α3亚单位外还有GABAA受体α6、β3、γ2、δ、θ、ε和π亚单位的表达。在肝癌细胞株HepG2细胞中,检测到GABA生成过程中的关键酶GAD67表达。通过细胞增殖能力研究发现,GABA对肝癌细胞株HepG2具有促增殖的作用。当GABRA3基因被沉默后HepG2细胞的增殖能力明显降低。对GABRA3基因被沉默的HepG2细胞给予GABA药物处理,结果发现其增殖能力非但没有增强,反而有减弱的趋势。结论:GABRA3基因在肺癌和肝癌中表达上调,其表达量与肿瘤的分化程度密切相关。在肝癌中,肝癌细胞可经GAD67催化产生GABA;GABA发挥了促肿瘤细胞增殖的作用,其作用是通过上调表达的GABRA3介导的。除GABRA3外,肝癌和肺癌组织中还有GABAA受体其他亚单位的表达,当GABRA3被沉默时,GABA通过这些亚单位发挥了抑制肿瘤细胞增殖的作用。第三章HTA基因的表达谱分析及功能研究目的:对HTA基因进行生物信息学分析,并对该基因进行表达谱分析及功能初步研究。方法:采用RT-PCR法分析HTA基因的表达谱,通过RNAi对该基因的功能进行初步研究,采用各种在线工具软件对该基因进行生物信息学分析。结果:通过RT-PCR检测到HTA基因在人肝癌细胞株HepG2以及多种肿瘤组织中表达,在肝癌中表达阳性率较高,而在正常肝细胞株L-0以及20种正常组织标本均无表达。采用RNAi技术抑制HTA基因在肝癌HepG2细胞中的表达,通过细胞生长曲线、细胞倍增时间、软琼脂集落形成实验、细胞周期检测以及裸鼠成瘤实验研究发现,HTA基因被沉默后HepG2细胞的增殖能力降低。经生物信息学分析,HTA定位于人类染色体16q22.3,包含了3个外显子和2个内含子。其编码的蛋白质为一个分子量较小的碱性亲水性蛋白,定位于细胞核和细胞浆的可能性较大,可能含有7个磷酸化位点、6个糖基化位点以及4个抗原表位。HTA编码蛋白的二级结构中α-螺旋为33.70%,β-折叠为5.43%,属于混合蛋白。结论:HTA基因特异性表达于肿瘤组织,在肝癌中表达阳性率较高,可能是一种肿瘤特异性基因。该基因具有促进肝癌细胞增殖的作用。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩写词简表
• 前言
• 技术路线
• 第一章 肿瘤标志物的生物信息学筛选及其表达谱初步分析
• 第一节 材料和方法
• 1.材料
• 1.1 主要生物信息学分析网站资源
• 1.2 细胞
• 1.3 主要试剂
• 1.4 主要仪器和设备
• 1.5 主要引物
• 2.方法
• 2.1 常规细胞培养
• 2.2 eDNA Xprofile筛选肿瘤差异表达基因
• 2.3 电子杂交
• 2.4 培养细胞总RNA提取
• 2.5 RT-PCR扩增
• 2.6 灰度扫描与数据处理
• 第二节 结果
• 1.cDNA Xprofile筛选得到的肿瘤特异性基因
• 2.筛选得到的肿瘤特异性基因的染色体定位
• 3.电子杂交表达谱分析
• 4.验证电子杂交结果
• 第三节 讨论
• 第二章 GABRA3基因的表达谱分析及功能研究
• 第一节 材料和方法
• 1.材料
• 1.1 细胞
• 1.2 组织
• 1.3 实验动物
• 1.4 主要引物
• 1.5 siRNA
• 1.6 主要试剂
• 1.7 主要仪器设备
• 2.方法
• 2.1 常规细胞培养
• 2.2 RNA提取
• 2.3 RT-PCR
• 2.4 灰度扫描与数据处理
• 2.5 免疫组织化学
• 2.6 稳定转染siRNA人肝癌细胞株HepG2的建立
• 2.7 细胞增殖能力测定
• 2.8 裸鼠成瘤实验
• 2.9 统计学分析
• 第二节 结果
• 1.细胞及组织总RNA分离
• 2.GABRA3表达谱
• 3.GABA对人肝癌细胞株HepG2恶性表型的影响
• 4.稳定转染siRNA人肝癌细胞株HepG2的建立及干扰效果鉴定
• 5.GABRA3在决定人肝癌细胞株HepG2恶性表型中的作用
• 6.GABA在人肝癌细胞株HepG2中通过GABRA3发挥促增殖作用
• 7.GAD在HepG2中的表达
• 第三节 讨论
• 第三章 HTA基因的表达谱分析及功能研究
• 第一节 材料和方法
• 1.材料
• 1.1 细胞和组织
• 1.2 实验动物
• 1.3 质粒和宿主菌
• 1.4 主要引物
• 1.5 siRNA
• 1.6 主要试剂
• 1.7 主要仪器设备
• 1.8 主要生物信息学分析网站资源
• 1.9 主要生物信息学软件
• 2.方法
• 2.1 常规细胞培养
• 2.2 RNA提取
• 2.3 RT-PCR
• 2.4 稳定转染siRNA人肝癌细胞株HepG2的建立
• 2.5 细胞增殖能力测定
• 2.6 HTA基因编码蛋白质性质、功能分析
• 2.7 HTA的原核表达
• 2.8 统计学分析
• 第二节 结果
• 1.细胞及组织总RNA分离
• 2.HTA表达谱
• 3.稳定转染siRNA人肝癌细胞株HepG2的建立及干扰效果鉴定
• 4.HTA在决定人肝癌细胞株HepG2恶性表型中的作用
• 5.生物信息学分析
• 6.HTA的原核表达
• 第三节 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 致谢
• 在读期间主要研究成果