人DR5胞外区域多克隆抗体的制备及其诱导肿瘤细胞凋亡的初步研究

论文摘要

诱导肿瘤细胞凋亡是多种癌症治疗方法之一。在癌症治疗中肿瘤坏死因子受体（TNFR）超家族的死亡受体已经成为最具有潜力的治疗靶位点之一。DR5（Death receptor 5）是TNFR超家族成员之一,胞内结构含有死亡结构域（Deathdomain,DD）,与其配体TRAIL（TNF-related apoptosis-inducing ligand）特异性结合后介导TRAIL的凋亡信号,最终导致肿瘤细胞凋亡。抗人DR5单克隆抗体能够有效杀死肿瘤细胞,并对正常细胞无细胞毒作用,因而成为抗肿瘤抗体药物研究和开发的热点。但是单抗制备繁琐且成本高,在临床上尚难广泛应用。而多克隆抗体制备简单且价格便宜。目前尚未见抗人DR5多克隆抗体对肿瘤杀伤作用的报道。因此我们制备了抗人DR5多克隆抗体,初步研究了人DR5多抗诱导肝癌细胞系凋亡的效果。本文采用RT-PCR方法从人肝癌细胞HepG2中成功克隆出人DR5胞外区域（eDR5）,构建重组克隆载体pMD-eDR5测序鉴定正确后构建三种原核重组表达载体pET-Trx-eDR5（P1P2）,pGEX-eDR5（P1P2）和pET-26b（+）-eDR5（P3P4）并经IPTG诱导在大肠杆菌中获得不同程度表达。我们选用了具有较高表达量且广泛用于表达重组蛋白的pGEX-eDR5（P1P2）重组表达载体,做进一步的研究。经Western blot鉴定,pGEX-eDR5证实所表达的融合蛋白是GST-eDR5。然后采用亲和层析法分离纯化融合蛋白GST-eDR5,再通过切胶、透析获得高纯度的融合蛋白GST-eDR5。用高纯度的免疫原（GST-eDR5）,免疫小鼠制备了抗人DR5多克隆抗体,并用GST蛋白纯化抗血清。纯化后的抗血清不再识别GST蛋白,但仍能识别HepG2细胞中的DR5蛋白和GST-eDR5融合蛋白。此血清纯化方案尚未见报道。通过Western blot、ELISA方法鉴定抗血清特异性和效价,获得高特异性,效价高达1:25600的抗DR5多克隆抗体。用制备好的抗人DR5多克隆抗体处理肝癌细胞HepG2和正常细胞,发现HepG2细胞在形态上有明显的变化,而正常细胞形态无明显变化。MTT法检测结果显示抗血清处理后的HepG2生长受到明显抑制。进一步用TUNEL法、Caspase 3的Western blot检测细胞凋亡,未获得明确的实验结果,有待于进一步实验。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 第一章 DR5 cDNA胞外区域的克隆与原核表达
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 细胞培养
• 1.2.2 引物的设计与合成
• 1.2.3 HepG2细胞总RNA的提取
• 1.2.4 RT-PCR
• 1.2.5 重组克隆载体的构建
• 1.2.6 DR5胞外区域原核融合表达载体的构建
• 1.2.7 重组表达载体在大肠杆菌中的诱导表达
• 1.2.8 SDS-PAGE电泳鉴定重组蛋白
• 1.2.9 原核表达条件的优化
• 1.2.10 融合蛋白GST-eDR5的可溶性和包涵体的分析
• 2 结果
• 2.1 肝癌细胞HepG2总RNA的提取
• 2.2 RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳鉴定
• 2.3 重组克隆载体和重组表达载体的酶切鉴定及测序结果
• 1P₂和P₃P₄）在大肠杆菌中的表达'>2.4 eDR5（P₁P₂和P₃P₄）在大肠杆菌中的表达
• 2.5 pGEX-eDR5诱导表达条件优化
• 2.6 GST-eDR5融合蛋白的包涵体与可溶性蛋白的检测
• 3 讨论
• 第二章 GST-eDR5融合蛋白的分离与纯化
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 GST-eDR5融合蛋白的确认
• 1.2.2 GST-eDR5亲和纯化
• 1.2.3 GST-eDR5切胶纯化
• 1.2.4 Bradford法测蛋白浓度
• 2 结果
• 2.1 融合蛋白GST-eDR5的Western blot鉴定
• 2.2 SDS-PAGE检测亲和柱纯化的融合蛋白GST-eDR5
• 2.3 纯化后的GST-eDR5的浓度测定
• 3 讨论
• 第三章 鼠抗人GST-eDR5多克隆抗体的制备与鉴定
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 鼠抗人GST-eDR5多克隆抗体的制备
• 1.2.2 抗血清的特异性检测
• 1.2.3 抗血清的效价检测
• 1.2.4 抗人GST-eDR5血清纯化
• 2 结果
• 2.1 抗GST-eDR5多克隆抗体的特异性检测
• 2.2 抗GST-eDR5多克隆抗体的效价检测——间接ELISA法
• 2.3 免疫共沉淀后的抗DR5血清的识别效果
• 3 讨论
• 第四章 抗人DR5多克隆抗体诱导肝癌细胞凋亡的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 肝癌细胞HepG2的培养
• 1.2.2 抗人DR5抗血清诱导肝癌细胞凋亡检测
• 1.2.3 抗人DR5抗血清对正常细胞的生长抑制检测
• 2 结果
• 2.1 抗血清处理后细胞形态的改变
• 2.2 MTT法生长抑制检测
• 2.3 TUNEL法检测细胞凋亡结果
• 2.4 Caspase 3的Western blot结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 文献综述
• 附录 表达载体图
• 致谢
• 攻读硕士期间参加的科研项目
• 攻读硕士期间发表的论文