NaHCO3胁迫下二色补血草基因的表达研究及VHA-c基因的功能验证

论文摘要

二色补血草是一种盐生开花植物,能够在盐碱化土地上正常生长,其优良的耐盐碱特性使之成为研究植物耐盐机理的理想材料。本研究结合表达序列标签（EST）技术和cDNA微阵列技术在转录水平上研究二色补血草耐盐碱机理,并对从文库中获得的液泡膜H+-ATPase c亚基基因进行了生物信息学分析、表达模式分析及功能验证。以400 mmol/L NaHCO3胁迫处理48h的二色补血草叶片为材料构建了cDNA文库,文库的初始滴度为9.6×105 pfu/ml,文库的重组率为95%,PCR检测插入片段的平均长度为0.9 kb。从cDNA文库中随机挑选2880个克隆进行序列测定,共筛选到2358个高质量的EST序列,建立了二色补血草EST数据库,它们GenBank的登录号为EH792855-EH795212;通过BlastX分析,共有1418条序列与已知基因序列高度同源,将这些EST序列根据MIPS分类标准分为12类,其中代谢、光合作用、功能未知、细胞防御及转运相关四类基因的表达丰度最高,分别占已分类EST总数的18.48%、14.6%、11.99%、11%和10.01%。EST分析表明,有245个EST是与早期逆境响应同源的基因,其中最显著的是金属硫蛋白（EH793637）和脂质转运蛋白（EH794695）,它们各自都占总EST的1.4%。选择1330条EST制作cDNA微阵列,获得了NaHCO3胁迫6h、24h和48h的二色补血草的转录表达谱,筛选到142条差异调节的转录本,6、24和48 h分别有108、43和46个基因出现明显的差异表达。基因芯片研究结果表明,有76%的基因确定是在胁迫早期（胁迫6h）差异表达,因此认为二色补血草在盐碱胁迫初始阶段的响应是重要的。对从二色补血草cDNA文库中获得的液泡膜H+-ATPase c亚基（VHA-c）基因进行了生物信息学分析,VHA-c基因cDNA全长729bp,其中开放读码框（ORF）为498bp,编码165个氨基酸,预测蛋白的分子量为16.6kD,理论等电点为8.62。利用实时荧光定量RT-PCR技术对该基因在二色补血草中的表达模式进行了分析,结果表明,NaCl诱导了VHA-c基因在二色补血草叶部的表达,抑制其在根部的表达;NaHCO3胁迫下,VHA-c基因分别于12h和6h时在叶部及根部表达量最高;Na2CO3胁迫6h时VHA-c基因在根部的表达量最大,48h在叶部大量表达。说明VHA-c基因能够对盐胁迫做出应答,确定该基因为耐盐相关基因。将该基因构建到植物表达载体pROKⅡ上,利用农杆菌介导法实现VHA-c基因对模式植物烟草的转化,通过耐盐性试验,对VHA-c基因进行功能验证。试验结果表明,盐胁迫后,转基因烟草的SOD和POD活性较非转基因烟草显著增加,MDA含量低于非转基因烟草,说明VHA-c基因的表达增强了植物清除活性氧的能力,并降低了植物的膜脂氧化程度,一定程度的提高了转基因烟草的耐盐能力,证实了来源于二色补血草的VHA-c基因具有提高植物耐受盐胁迫之能力的功能。植物的耐盐过程是一个复杂的多基因协同作用的体系。我们通过EST技术和cDNA芯片技术等基因组学研究手段,获得了盐胁迫下二色补血草的基因表达信息,为系统阐明二色补血草抗盐碱分子机理奠定坚实的基础,为进一步分析二色补血草的抗逆机理提供了数据;利用基因工程手段使外源VHA-c基因在烟草中组成型表达,不同程度提高转基因烟草对盐胁迫的耐受能力,为将VHA-c基因利用于林木耐性分子育种提供了重要的前提基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 植物的耐盐机理
• 1.1.1 植物的盐害
• 1.1.2 植物的耐盐性
• 1.2 基因组学方法在植物耐盐机理研究中的应用
• 1.2.1 EST分析技术及应用
• 1.2.2 cDNA微阵列技术在植物抗逆研究中的应用
• +-ATPase c亚基基因主要研究进展'>1.3 耐盐基因分类及液泡型H⁺-ATPase c亚基基因主要研究进展
• 1.3.1 耐盐基因的分类
• +-ATPase c亚基基因功能研究进展'>1.3.2 液泡型H⁺-ATPase c亚基基因功能研究进展
• 1.4 二色补血草简介
• 1.4.1 生物学特性
• 1.4.2 作为耐盐研究材料的可行性
• 1.5 本项研究的目的和意义
• 1.5.1 研究的目的
• 1.5.2 研究的意义
• 1.6 本研究的主要内容及技术路线
• 1.6.1 本研究的主要内容
• 1.6.2 技术路线
• 3胁迫下二色补血草基因表达的研究'>2 NaHCO₃胁迫下二色补血草基因表达的研究
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 酶及主要化学试剂
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 二色补血草总RNA提取
• 2.2.2 磁性球珠分离mRNA
• 2.2.3 cDNA第一、二链合成
• 2.2.4 cDNA末端处理与分步收集
• 2.2.5 cDNA连接与包装
• 2.2.6 插入片段的PCR检测
• 2.2.7 噬菌体的体外切除
• 2.2.8 菌体培养与保存
• 2.2.9 质粒提取
• 2.2.10 cDNA序列的测定
• 2.2.11 序列的编辑与分析
• 2.2.12 cDNA芯片的制备
• 2.2.13 荧光标记与芯片杂交
• 2.2.14 数据分析
• 2.2.15 cDNA芯片数据的可信度验证
• 2.2.16 EST序列分析及二色补血草表达谱的建立
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 总RNA提取
• 2.3.2 mRNA的分离
• 2.3.3 cDNA文库的构建及质量检测
• 2.3.4 cDNA文库测序
• 2.3.5 cDNA文库ESTs分析
• 2.3.6 cDNA芯片数据分析
• 2.3.7 二色补血草耐盐途径分析
• 2.4 本章小结
• 2.5 讨论
• 3 二色补血草VHA-c基因生物信息学分析及其在盐碱胁迫下的表达模式
• 3.1 二色补血草VHA-c基因的生物信息学分析
• 3.1.1 VHA-c亚基基因的序列分析
• 3.1.2 VHA-c基因的疏水性预测
• 3.1.3 VHA-c基因的跨膜区预测
• 3.1.4 VHA-c基因多序列比对与分子进化树分析
• 3.2 二色补血草VHA-c基因应答盐碱胁迫的表达模式
• 3.2.1 材料处理
• 3.2.2 实验方法
• 3.2.3 结果与分析
• 3.3 本章小结
• 3.4 讨论
• 4 二色补血草VHA-c基因对烟草的遗传转化
• 4.1 植物表达载体构建
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 实验方法
• 4.1.3 结果与分析
• 4.2 根癌农杆菌介导的烟草遗传转化
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 实验方法
• 4.3 转VHA-c基因烟草的分子检测
• 4.3.1 试剂
• 4.3.2 仪器设备
• 4.3.3 实验方法
• 4.3.4 结果与分析
• 4.3.5 本章小结
• 4.3.6 讨论
• 5 以烟草为载体的二色补血草VHA-c基因功能验证
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 植物材料
• 5.1.2 主要试剂
• 5.1.3 仪器设备
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 NaCl胁迫处理及取材
• 5.2.2 超氧化歧化酶（SOD）活性测定
• 5.2.3 过氧化物酶（POD）活性测定
• 5.2.4 丙二醛（MDA）含量测定
• 5.2.5 相对生长量测定
• 5.2.6 相对含水量测定
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 NaCl胁迫下转VHA-c基因烟草SOD活性比较
• 5.3.2 NaCl胁迫下转VHA-c基因烟草POD活性比较
• 5.3.3 NaCl胁迫下转VHA-c基因烟草MDA含量比较
• 5.3.4 NaCl胁迫下转VHA-c基因烟草相对生长量比较
• 5.3.5 NaCl胁迫下转VHA-c基因烟草相对含水量比较
• 5.4 本章小结
• 5.5 讨论
• 6 讨论
• 3胁迫二色补血草基因表达谱的建立'>6.1 NaHCO₃胁迫二色补血草基因表达谱的建立
• 6.2 二色补血草的耐盐途径分析
• 6.3 二色补血草VHA-c基因及其在盐胁迫下的表达模式分析
• 6.4 二色补血草VHA-c基因对烟草的遗传转化及耐盐性分析
• 6.4.1 转基因烟草的耐盐性增强
• 6.4.2 转基因烟草耐盐性提高与Northern杂交结果的相关性分析
• 6.4.3 VHA-c基因功能评价
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢