重组HLA-G1基因的克隆、原核表达、纯化及功能的初步研究

论文摘要

HLA-G是一种非经典的HLA-Ⅰ类分子,与人类免疫耐受有关。诱导对移植抗原的免疫耐受是使移植物获得长期存活的关键。人类和哺乳动物的妊娠过程是自然界中存在的一种天然的同种半异体免疫耐受模型。在母胎界面的细胞滋养层上高表达的HLA-G能够抑制子宫蜕膜NK细胞的杀伤活性,在保护胎儿不被母体排斥的过程中具有重要的作用。但HLA-G究竟是哪些特定构象或氨基酸同NK细胞上其特异性受体相互作用,目前尚没有明确的结论。我们研究的目的就是通过比较正常和特定氨基酸的突变的HLA-G分子与特异性受体之间的作用力的强弱及功能活性变化来探讨HLA-G与其受体的作用机制。 本研究用基因工程技术将BirA酶底物肽（BSP）的编码基因克隆到MHC分子上,利用其与生物素特异性稳定结合的能力及生物素的多价性,将MHC分子捆绑成四聚体复合物,从而在MHC分子与KIR结合的过程中从而标记和识别NK细胞。本试验研究的目的就是构建和表达该融合蛋白,为HLA-G1与其受体的作用机制研究奠定基础。 研究利用PCR的方法分别扩增了HLA-G1的胞外功能基因和BSP基因,用SOE PCR将它们拼接成融合基因（HB）,并将HB克隆至载体pET28a,成功构建成了表达载体pET28a-HB。将其转化BL21（DE3）菌,在最佳的诱导表达条件下,即37℃,在含1mmol/L的IPTG的LB培养基中融合蛋白和hβ 2M分别于诱导5h,3h,两蛋白均以包涵体的形式得到了大量的表达。SDS-PAGE电泳显示其分子量分别为36kD和11kD,与预期相符。在Western blot免疫印迹分析,融合蛋白与87G单克隆抗体,hβ 2M与其腹水多克隆抗体发生特异性反应。由于融合蛋白在大肠杆菌中表达始终形成包涵体,而HLA-G胞外区本身含有两个二硫键,给为蛋白质正确折叠造成很大困难,因此,在对表达产物形成的包涵体溶解、洗涤、复性等一系列过程中,摸索出融合蛋白HLA-G1复性的最适条件,提高其复性率。融合蛋白包涵体经6mol/L的尿素溶解后用Co2+离子树脂纯化,获得理想的纯化效果。hβ 2M蛋白包涵体经洗涤溶解后目的蛋白浓度占全部包涵体蛋白的30%,满足辅助HLA-G1融合蛋白复性的要求。 重组融合蛋白HLA-G1在与hβ 2M稀释法共复性,超滤浓缩后,在10μg/ml的浓度下,分别以NK92和K562细胞为效应细胞和靶细胞,在5:1和2.5:1的效靶比例下,用乳酸脱氢酶法（LDH法）测定NK细胞对K562细胞的杀伤活性。结果表明10μg/ml HLA-G1融合蛋白能显著抑制NK细胞的杀伤活性,加入1.9μg/ml HLA-G1融合蛋白抗体87G能阻断大部分HLA-G1的抑制活性。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要（Abstract）
• 主要缩略语
• 插图和附表清单
• 第一章 前言
• 1.1 文献综述
• 1.2 研究的目的与意义
• 第二章 截断型 HLA-G1融合蛋白重组载体的构建
• 2.1 引言
• 2.2 材料
• 2.3 方法
• 2.4 结果与分析
• 2.5 讨论
• 第三章 重组蛋白HLA-G1和hβ2M蛋白的表达、纯化、复性及鉴定
• 3.1 材料
• 3.2 方法
• 3.3 结果与分析
• 3.4 讨论
• 第四章 重组HLA-G1蛋白对NK细胞的活性
• 4.1 材料与方法
• 4.2 结果
• 4.3 讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 作者简历