大青杨纤维素合酶基因的克隆与遗传转化的研究

论文摘要

纤维素是地球上含量最丰富的重要可再生资源,然而植物中纤维素的生物合成机制人们却所知甚少。杨树是林木分子生物学研究的模式植物,也是我国分布最广的重要的速生材树种之一,因此研究其纤维素生物合成的分子机理对于林木纤维素的分子改良具有非常重要的现实意义。本研究针对大青杨纤维素合酶PuCesA6和PuCesA7进行了研究,据报道PuCesA6基因与茎的伸长有关,而PuCeSA7基因可能与初生壁的形成有关。以大青杨叶片为试验材料,提取叶片总DNA,克隆出PuCesA6基因DNA全长序列5760 bp,与欧洲颤杨的PtrCesA6全长cDNA的相似性为99%,含有13个外显子共3812 bp及12个内含子共1948 bp；克隆得到PuCesA7基因片段2341 bp,与欧洲颤杨的PtrceSA7全长cDNA的相似性为98%。提取大青杨叶片总RNA,通过RT-PCR克隆了纤维素合成酶PuCesA6基因cDNA全长序列及PucesA7基因cDNA片段。序列分析表明,PucesA6基因cDNA全长3778bp,包括5’UTR区66 bp,3’UTR区448 bp,开放读码框3264 bp,共编码1087个氨基酸,该基因编码蛋白的分子量为122.51 kDa,等电点为6.57；具有典型的植物纤维素合酶的高度保守特征：在N末端区有一锌指状结构,具有4个保守序列CxxC,随后为一高变区（HVR-I）和两个跨膜区（TM）,靠近C末端有另六个跨膜区（TM）,在第第三跨膜区之间为另一高变区（HVR-Ⅱ）和与p-糖苷转移酶有关的保守序列Dx..xDxD及QxxRW.分子进化分析表明PuCesA6蛋白与PtrCesA6蛋白亲缘关系最近。将带酶切位点的PuCesA6基因cDNA开放读码框序列与CaMV35S-sGFP-NOS瞬时表达载体重组,25℃暗培养2-4 h,并通过基因枪法轰击洋葱表皮细胞对PuCesA6蛋白进行亚克隆定位,在Zeiss激光扫描共聚焦显微镜下观察GFP荧光在洋葱表皮细胞中的位置,初步显示GFP荧光位于细胞壁或细胞膜上,随后对洋葱表皮细胞进行质壁分离处理,结果表明,PuCeSA6蛋白定位于细胞膜上。设计带酶切位点的引物克隆PuCesA6基因cDNA开放读码框序列,与植物表达载体pROKII重组,将重组后的全长PuCesA6基因正义表达载体命名为pROKII-P6XbaIKpnI。以根癌农杆菌EHA 105介导,进行烟草的基因转化,确定了烟草转化分化培养基类型,基本程序为预培养两天、侵染5-10 min、共培养2-4天、采用前期选择、延迟选择和后期选择。共培养后选择培养基中选择压为卡那霉素100 mg/L,农杆菌抑菌剂为羧苄青霉素500 mg/L。提取在选择培养基上正常生长的烟草苗的DNA,采用联合PCR检测,即NPTⅡ基因PCR检测和目的基因PCR检测。最后进行Southern杂交检测,结果与联合PCR检测相符,阳性植株有强烈的杂交信号,阴性对照物杂交信号。与野生型烟草相比,正义转基因烟草在植株形态上表现为株高生长受到抑制,通过测量纤维细胞长度发现,正义转基因烟草纤维细胞长度小于对照,且差异极显著。将克隆的带酶切位点的PuCesA7基因cDNA片段,反向与植物表达载体pROKII重组,成功构建PuCesA7基因反义表达载体pROKII-P7SacIKpnI,用根癌农杆菌介导方法转化烟草,通过联合PCR检测及Southern检测,筛选出阳性植株。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 纤维素的结构及功能
• 1.2 植物纤维素合成酶基因研究概况
• 1.2.1 植物纤维素合成酶基因的发现
• 1.2.2 植物纤维素合成酶基因的命名
• 1.2.3 植物纤维素合成酶的基因结构
• 1.2.4 纤维素合成酶相似蛋白
• 1.2.5 植物纤维素合成酶CesA的表达规律
• 1.2.6 纤维素的生物合成
• 1.2.7 纤维素合成酶功能的研究方法
• 1.2.8 参与纤维素生物合成的其它基因
• 1.3 林木纤维素合成酶基因研究进展
• 1.4 现阶段尚需解决的问题
• 1.5 本研究的目的、意义和主要内容
• 1.6 研究的试验内容与技术路线
• 1.6.1 试验内容
• 1.6.2 技术路线
• 2 大青杨叶片总DNA的提取
• 2.1 实验材料与方法
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 主要试剂与仪器
• 2.1.3 提取方法
• 2.1.4 总DNA质量检测与分析
• 2.1.5 酶切反应
• 2.1.6 RAPD反应
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 不同提取方法对总DNA提取的影响
• 2.2.2 限制性内切酶酶解结果和RAPD反应结果
• 2.3 讨论
• 2.4 本章小结
• 3 大青杨纤维素合成酶基因（PuCesA6、PuCesA7）DNA片段的克隆与鉴定
• 3.1 实验材料与试剂
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 试剂与仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 引物设计
• 3.2.2 总DNA的提取
• 3.2.3 PuCesA6、PuCesA7基因DNA片段的PCR扩增
• 3.2.4 目的片段的回收
• 3.2.5 目的片段与pMD18-T载体的连接转化测序
• 3.2.6 测序结果的分析方法
• 3.3 结果与分析
• 3.4 讨论
• 3.5 本章小结
• 4 大青杨叶片总RNA的提取
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 植物材料
• 4.1.2 主要试剂及处理
• 4.1.3 提取方法
• 4.1.4 总RNA质量检测与分析
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 电泳检测
• 4.2.2 总RNA浓度及纯度检测
• 4.3 讨论
• 4.4 本章小结
• 5 大青杨纤维素合成酶基因（PuCesA6、PuCesA7）cDNA的克隆与分析
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 试验材料
• 5.1.2 试验方法
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 目的基因的扩增
• 5.2.2 序列分析
• 5.2.3 纤维素合酶蛋白的分子进化分析
• 5.3 讨论
• 5.4 本章小结
• 6 纤维素合酶PuCesA6蛋白的亚细胞定位
• 6.1 材料
• 6.1.1 主要材料和试剂
• 6.1.2 主要使用仪器
• 6.2 方法
• 6.2.1 带酶切位点的PuCesA6基因ORF的扩增
• 6.2.2 瞬时表达载体的构建
• 6.2.3 洋葱表皮细胞瞬时表达（基因枪法）
• 6.3 结果与分析
• 6.3.1 瞬时表达载体构建及双酶切鉴定
• 6.3.2 PuCesA6基因在洋葱表皮的瞬时表达
• 6.4 讨论
• 6.5 本章小结
• 7 PuCesA6正义表达载体的构建及遗传转化烟草
• 7.1 试验材料
• 7.1.1 菌株与载体
• 7.1.2 主要试剂
• 7.1.3 主要仪器
• 7.2 方法
• 7.2.1 带酶切位点的PuCesA6基因cDNA的扩增与鉴定
• 7.2.2 正义表达载体的构建
• 7.2.3 大青杨PuCesA6基因正义转化烟草
• 7.2.4 烟草纤维细胞长度的测量
• 7.3 结果与分析
• 7.3.1 PuCesA6正义表达载体的构建与酶切鉴定
• 7.3.2 烟草叶片培养基的优化
• 7.3.3 农杆菌介导的烟草叶盘法基因转化因素处理结果
• 7.3.4 正义转基因烟草的检测
• 7.3.5 正义转基因烟草的特征
• 7.4 讨论
• 7.4.1 影响转化效率的因素
• 7.4.2 正义表达转基因烟草的表现特征
• 7.5 本章小结
• 8 PuCesA7反义表达载体的构建
• 8.1 试验材料
• 8.1.1 菌株与载体
• 8.1.2 主要试剂
• 8.1.3 主要仪器
• 8.2 方法
• 8.2.1 带酶切位点的PuCesA7基因cDNA的扩增与鉴定
• 8.2.2 反义表达载体的构建
• 8.3 结果与分析
• 8.4 讨论
• 8.5 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢