对虾白斑综合症病毒膜蛋白VP38和VP150的鉴定和功能的初步研究

论文摘要

对虾白斑综合症病毒（white spot syndrome virus,WSSV）是一种具有囊膜、无包涵体的杆状型双链环状DNA病毒,也是严重危害对虾养殖业的最主要病原。本论文围绕病毒膜蛋白开展研究,包括以下两个部分。（1）质谱分析发现病毒膜蛋白VP38是ORF wsv259的编码产物。随后在E.coli BL-21菌株中表达纯化了GST-VP38并制备了相应的抗血清。利用Far-Western blotting和GST pull-down分析发现VP38和另一个病毒膜蛋白VP24有相互作用。进一步分别重组表达了VP38的N-端VP38n（aa 1-142）和C-端VP38c（aa 143-309）,GST pull-down分析结果表明VP38与VP24的相互作用位点在C-端。（2）WSSV ORF wsv 011编码产物VP150是病毒中一个比较独特的膜蛋白,由1301个氨基酸组成,预测分子量约144kDa。质谱分析发现在病毒粒子中VP150存在降解现象。从vp150基因的两端各选约600 bp,分别命名为vp150n、vp150c,而后在E.coli BL-21菌株中表达纯化了VP150n和VP150c并制备了相应的抗血清。通过Western blot初步发现从血液中和组织中提纯的WSSV病毒粒子中VP150降解程度存在区别,推测它是病毒成熟过程中的重要蛋白。对病毒膜蛋白性质以及它们之间相互作用研究是了解病毒入侵、包装、成熟和释放的重要步骤,将为防治病毒奠定科学依据。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 1 对虾白斑综合症病毒（WSSV）及其分子生物学研究
• 1.1 对虾白斑综合症病毒研究概况
• 1.1.1 对虾白斑综合症病毒的发现
• 1.1.2 对虾白斑综合症病症及组织病理学
• 1.1.3 对虾白斑综合症病毒的形态特征
• 1.1.4 对虾白斑综合症病毒的感染宿主及感染动物模型
• 1.1.5 对虾白斑综合症病毒的分离纯化
• 1.2 对虾白斑综合症病毒的基因组学研究
• 1.3 对虾白斑综合症病毒的蛋白质组学研究
• 1.3.1 对虾白斑综合症病毒的结构蛋白
• 1.3.2 对虾白斑综合症病毒的功能酶类
• 2 本论文研究的内容和意义
• 第一部分 对虾白斑综合症病毒膜蛋白VP38基因的鉴定
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.2.1 WSSV完整病毒和核衣壳的制备
• 2.2.2 基因的克隆表达和蛋白质纯化
• 2.2.3 多克隆抗体的制备
• 2.2.4 Western blot分析
• 2.2.5 Far-Western分析
• 2.2.6 GST pull-down分析
• 3 结果
• 3.1 vp38基因的结构
• 3.2 GST-VP38、GST-VP38n和GST-VP38c的诱导表达和纯化
• 3.3 Western blot分析
• 3.4 VP38与VP24之间的相互作用
• 3.5 GST pull-down分析VP38n,VP38c和VP24的相互作用
• 4 讨论
• 第二部分 对虾白斑综合症病毒膜蛋白VP150基因的初步鉴定
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.2.1 pGEX-2T-vp150n-（6His）和pGEX-2T-vp150c-（6His）重组表达质粒的构建
• 2.2.2 GST-VP150n-（6His）和GST-VP150c-（6His）在E.coli BL-21中的表达
• 2.2.3 Ni-NTA柱变性条件下纯化重组蛋白及蛋白复性
• 2.2.4 多克隆抗体的制备
• 2.2.5 Western blot分析
• 2.2.6 从感染病毒的螯虾血液中提取WSSV
• 2.2.7 WSSV病毒蔗糖密度梯度超速离心
• 2.2.8 WSSV膜蛋白蛋白酶活性的测定
• 3 结果
• 3.1 vp150基因的结构
• 3.2 GST-VP150n-（6His）和GST-VP150c-（6His）在E.coli BL-21中的诱导表达和纯化
• 3.3 Western blot分析
• 3.4 血液提取WSSV和组织提取WSSV中VP150的降解分析
• 3.5 WSSV膜蛋白的蛋白酶活性初步测定
• 4 讨论
• 参考文献
• 缩略词
• 附录
• 致谢