硫化氢对oxLDL诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡的影响及其机制研究

论文摘要

目的:观察硫化氢（hydrogen sulfide,H2S）对内皮细胞凋亡的影响,并从抗氧化的角度初步探讨其作用的机制。方法:1.人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）分别经不同浓度（25、50、100、200μmol /L）和不同时间（6、12、24h）硫氢化钠（sodium hydrosulfide,NaHS）预孵育24h后加入100μg/ml氧化低密度脂蛋白（oxidized LDL,oxLDL）处理24h,以空白组和100μg/ml oxLDL处理24h组作为对照,Hoechst 33258荧光染色观察细胞核形态的变化;碘化丙啶（propidium iodide, PI）染色流式细胞术（flow cytometry, FCM）检测细胞凋亡;2.实验分为四组:①对照组:含10%胎牛血清RPMI-1640培养基;②NaHS+oxLDL组:50μmol /L NaHS孵育HUVECs 24h后再加入100μg/ml oxLDL孵育24h;③oxLDL处理组:100μg/ml oxLDL孵育HUVECs24h;④NAC+oxLDL组:1 mmol/L N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine,NAC,抗氧化剂）孵育HUVECs 24h后再加入100μg/ml oxLDL孵育24h。双氢罗丹明123（Dihydrohodamine 123, DHR123）染色后,镜下观察和FCM测定HUVECs的DHR123荧光强度,以明确细胞内活性氧（reactive oxygen species, ROS）含量的变化情况;罗丹明123（Rhodamine 123, Rh123）染色后,镜下观察和FCM测定HUVECs的Rh123荧光强度,以了解细胞线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential,△Ψm）的变化情况;Western Blot检测细胞Caspase-3和Caspase-9蛋白质的表达。结果:1. H2S抗oxLDL诱导的HUVECs凋亡①Hoechst 33258染色荧光显微镜观察发现,与正常对照组相比, oxLDL （100μg/ml）处理组HUVECs中出现大量的核呈浓染致密的固缩形态或颗粒状荧光的凋亡细胞,而NaHS不同浓度（25、50、100、200μmol /L）和不同时间（6、12、24h）预处理的HUVECs中细胞核呈浓染致密的固缩形态或颗粒状荧光的细胞数明显减少,大部分细胞染色质呈弥漫均匀的低强度荧光。②FCM结果显示,与正常对照组相比,oxLDL（100μg/ml）处理组细胞凋亡率明显增加（p <0.01）,而不同浓度（25、50、100、200μmol /L）NaHS预处理组较oxLDL（100μg/ml）处理组细胞凋亡率分别降低80%、85%、89%、92%（均p <0.01）;不同时间（6、12、24h）NaHS预处理组较oxLDL（100μg/ml）处理组细胞凋亡率分别降低80%、81%、84%（均p <0.01）,50、100、200μmol /L NaHS预处理24h抗凋亡作用最明显。2.H2S抗oxLDL诱导的HUVECs凋亡的作用机制①HUVECs经DHR123染色后,荧光显微镜观察发现,与对照组比较,oxLDL处理组HUVECs的DHR123荧光强度明显增强,50μmol /L NaHS或1 mmol/L NAC孵育24h后,再加入oxLDL 100μg/ml继续孵育24h的HUVECs DHR123荧光强度较100μg/ml oxLDL处理组明显减弱;FCM定量分析结果显示,与对照组比较,oxLDL处理组HUVECs的DHR123平均荧光强度升高了2.3倍（p <0.05）,50μmol /L NaHS或1 mmol/L NAC预处理HUVECs 24h的DHR123平均荧光强度较100μg/ml oxLDL处理组分别降低了63%和67%（均p <0.05）。表明H2S对oxLDL诱导的细胞内ROS的生成具有抑制作用。②HUVECs经Rh123染色后,荧光显微镜观察发现,与对照组比较,oxLDL处理组HUVECs的Rh123荧光强度明显减弱,50μmol /L NaHS或1 mmol/L NAC孵育24h后,再加入oxLDL 100μg/ml继续孵育24h的HUVECs Rh123荧光强度较100μg/ml oxLDL处理组明显增强;FCM定量分析结果显示,oxLDL处理组HUVECs的Rh123平均荧光强度较对照组降低56%（p <0.05）,50μmol /L NaHS或1 mmol/L NAC预处理HUVECs 24h的Rh123平均荧光强度较100μg/ml oxLDL处理组分别升高104%和126%（均p <0.05）。表明H2S对oxLDL降低HUVECs的△Ψm具有抑制作用。③Western Blot结果显示,100μg/ml oxLDL孵育HUVECs 24h后,与正常对照组相比,Caspase-3、Caspase-9蛋白的表达分别增加29%和24%;50μmol /L NaHS或1 mmol/L NAC预处理组与oxLDL处理组相比HUVECs的Caspase-3、Caspase-9蛋白表达分别降低19%、20%或12%、19%（均p <0.05）。oxLDL引起

论文目录

• 一 中文摘要
• 二 英文摘要
• 三 正文
• 前言
• 材料与方法
• 实验结果
• 讨论
• 结论
• 四 参考文献
• 五 主要缩略语英文索引
• 六 综述
• 七 成果目录
• 八 致谢