灵芝关键成分三萜酸的深层发酵技术研究

论文摘要

三萜酸是灵芝中除多糖外的另一种关键性药效成分,具有广泛的药理作用。由于灵芝子实体的培养周期较长,三萜的产量受外界因素影响较大,因此,从子实体中提取灵芝三萜酸具有较大的局限性。而深层发酵技术生产灵芝三萜具有培养时间短、三萜的质量指标容易精确控制等优点,已成为获取灵芝三萜酸的研究热点。本文在实验室前期研究的基础上,对灵芝三萜酸深层发酵的廉价型培养基和发酵条件进行了优化,并从植物源药物中筛选了可促进灵芝三萜酸形成的产物促进因子,进一步在30L机械搅拌罐中进行了放大试验,初步构建了灵芝三萜酸的发酵动力学模型,获得了灵芝三萜酸高效发酵的系统技术。主要研究结果如下1.通过选择廉价的粮食型碳、氮源,并通过单一和组合的方式作为培养基组分添加到发酵基础培养基中,发现灵芝菌丝体细胞对所供试的粮食型碳源和氮源都有所较好的利用,且组合添加方式优于单一添加方式。进一步采用Box-Behnken设计和响应面法对发酵的关键性培养基组分葡萄糖（A）、玉米粉（B）、麸皮粉（C）和蛋白胨（D）进行了优化,得到了可预测灵芝胞内三萜酸产量的回归模型：Y1=233.40+13.15A+7.09B+7.34C+4.90D+2.95AB+5.30AC+1.93AD+2.33BC+6.83BD－0.81CD－36.36A2－19.38B2－25.94C2－23.76D2。获得胞内三萜酸发酵的最佳培养基水平为：葡萄糖26.0g/L,玉米粉11.2g/L,麸皮粉10.8g/L,蛋白胨5.9g/L。对模型的验证试验表明,该模型的预测结果与灵芝实际发酵产胞内三萜酸的结果基本一致,具有实践应用价值。2.单因素实验结果表明,起始pH、摇床转速和培养温度为灵芝三萜酸发酵的关键因素。通过中心组合旋转设计和响应面法优化,得到了灵芝胞内三萜酸（Y1）和胞外三萜酸（Y2）对这三个关键因素的多元回归方程：Y1=282.00+4.41A+7.19B+3.02C+0.079AB－2.38AC－2.24BC－38.57A2－36.95B2－31.25C2；Y2=245.98－12.53A+8.99B+4.98C+0.20AB－0.71AC－1.24BC－29.00A2－28.50B2－31.83C2。胞内三萜酸发酵的最佳培养条件为：起始pH6.0,摇床转速161.9r/min,培养温度30.1℃；胞外三萜酸发酵的最佳培养条件为：起始pH5.9,摇床转速163.1r/min,培养温度30.2℃。两产物的最佳条件没有显著差异,为便于实际应用,两产物的最佳条件修正为起始pH6.0,摇床转速160r/min,培养温度30℃。3.研究了10种植物药水提物和乙醇提取物对灵芝细胞生长和胞内、胞外三萜酸形成的影响。结果表明,不同植物药水提物和醇提物对灵芝细胞生长和胞内、胞外三萜酸形成的影响差异显著。桔梗水提物和醇提物能显著促进灵芝生长和三萜酸的形成（P<0.05）；枸杞子和金银花提取物在低浓度时也能显著促进细胞生长和三萜酸的形成；但板蓝根、石槲和银杏叶的提取物对灵芝的生长和三萜酸的形成都具有一定的抑制作用。4.通过对灵芝三萜酸深层发酵的过程进行分析,发现灵芝菌丝体的生长和三萜酸的形成属于生长偶联型。通过Sigmoid模型建立灵芝三萜酸的发酵模型,应用相应软件对实验数据进行处理计算,得到了菌丝体生长、胞内三萜酸和胞外三萜酸合成,以及底物消耗的动力学模型及其参数。模型与实验数据拟合较好,表明得到的这四个模型能基本揭示灵芝三萜酸发酵代谢的过程特征,为灵芝三萜酸30L规模的发酵以及今后进一步的发酵放大提供了参考。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 名词缩略表
• 1 绪论
• 1.1 研究背景
• 1.2 灵芝深层发酵技术研究概况
• 1.2.1 培养基组成对灵芝深层发酵的影响
• 1.2.2 发酵条件对灵芝深层发酵的影响
• 1.2.3 灵芝三萜酸深层发酵的研究
• 1.3 灵芝三萜的结构与光谱特征
• 1.3.1 灵芝三萜的结构特点
• 1.3.2 灵芝三萜类化合物的光谱特征
• 1.4 灵芝三萜酸的提取与分离纯化
• 1.4.1 灵芝三萜酸的提取方法
• 1.4.2 灵芝三萜酸的分离纯化
• 1.5 本论文研究的目的和意义及主要内容
• 1.5.1 目的和意义
• 1.5.2 研究内容
• 2 灵芝三萜酸廉价型发酵培养基的优化
• 2.1 材料
• 2.1.1 主要试剂
• 2.1.2 主要仪器
• 2.1.3 灵芝培养基
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 灵芝培养
• 2.2.2 灵芝液体发酵
• 2.2.3 试验设计
• 2.2.4 生物量的测定
• 2.2.5 灵芝胞内三萜酸的提取
• 2.2.6 灵芝三萜酸的测定
• 2.2.7 统计分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 不同碳源对灵芝发酵的影响
• 2.3.2 不同氮源对灵芝发酵的影响
• 2.3.3 灵芝胞内三萜酸发酵培养基优化
• 2.4 小结与讨论
• 3 灵芝三萜酸深层发酵条件的优化
• 3.1 材料
• 3.1.1 主要试剂
• 3.1.2 主要仪器
• 3.1.3 灵芝培养基
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 灵芝培养
• 3.2.2 灵芝液体发酵培养
• 3.2.3 生物量的测定
• 3.2.4 灵芝三萜酸的提取
• 3.2.5 灵芝三萜酸的测定
• 3.2.6 统计分析
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 灵芝三萜酸深层发酵参数的研究
• 3.3.2 灵芝三萜酸深层发酵过程的优化
• 3.4 小结与讨论
• 4 植物药提取物对灵芝三萜酸发酵的影响
• 4.1 材料
• 4.1.1 主要试剂
• 4.1.2 主要仪器
• 4.1.3 植物药
• 4.1.4 灵芝培养基
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 植物药提取物的制备
• 4.2.2 灵芝摇瓶发酵培养
• 4.2.3 生物量的测定
• 4.2.4 灵芝三萜酸的提取
• 4.2.5 灵芝三萜酸的测定
• 4.2.6 统计分析
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 植物药水提物对灵芝摇瓶发酵的影响
• 4.3.2 植物药醇提物对灵芝摇瓶发酵的影响
• 4.4 小结与讨论
• 4.4.1 对灵芝细胞生长的影响
• 4.4.2 对灵芝胞内三萜酸形成的影响
• 4.4.3 对灵芝胞外三萜酸形成的影响
• 5 灵芝三萜酸发酵动力学研究
• 5.1 材料
• 5.1.1 主要试剂
• 5.1.2 主要仪器
• 5.1.3 灵芝培养基
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 灵芝发酵培养
• 5.2.2 生物量的测定
• 5.2.3 还原糖的测定
• 5.2.4 灵芝三萜酸的提取及测定
• 5.2.5 统计分析
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 灵芝深层发酵产三萜酸
• 5.3.2 灵芝发酵生产三萜酸的Sigmoid模型
• 5.3.3 动力学相关参数求解
• 5.4 小结与讨论
• 6 主要结论
• 参考文献
• 附录A
• 附录B （攻读学位期间的主要学术成果）
• 致谢