姜黄素激活Nrf2-ARE通路保护丙烯腈对大鼠星形胶质细胞毒性的研究

论文摘要

研究背景和目的:活性氧（reactive oxygen species,ROS）是一组含有化学性质活泼的含氧功能基团的化合物,是生物体内的主要自由基。它具有强烈引发脂质过氧化的作用,几乎可与任何细胞成分发生反应,引起链式脂质过氧化反应,造成细胞的凋亡、坏死和功能失调。正常情况下机体内ROS的产生和清除处于动态平衡状态。而当处于氧化应激状态时,机体抗氧化能力下降,组织细胞ROS增多,组织脂质过氧化水平升高,引起DNA氧化损伤和蛋白质表达异常,从而对机体造成损害。它在老年痴呆症、帕金森病等神经退行性疾病及化学中毒性神经损伤的发生发展过程中,扮演着重要角色。丙烯腈（Acrylonitril,AN）是有机合成工业的重要原料,广泛应用于合成腈纶纤维、丁腈橡胶、工程塑料、合成树脂等。近年来由于相关产业的发展及AN制品不断走进生活,职业和生活接触机会明显增多,为保护接触人群健康,国内外学者对其毒性特别是神经毒性进行了积极探索。但AN对神经系统毒作用以及确切机理迄今尚不清楚。已有研究表明,AN降低机体抗氧化能力,诱导氧化应激,因而从氧化-抗氧化角度深入探讨AN神经毒性的机理以及寻求有效的化学防护剂已成为AN毒理学研究的热点。姜黄素（Curcumin,CUR）是从姜科植物姜黄（Cuma Longa L.）根茎中提取出来的一种酚类色素成分,由于其色泽稳定且毒性很低,目前已广泛应用于食品添加剂和染料中。众多研究结果提示,CUR具有抗炎、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤、抗氧化、清除自由基等多方面药理作用。对肝脏、肾脏和免疫系统等多方面都显示了较好的保护作用。但到目前为止,有关CUR神经保护作用和机制研究的相关报道还不是很多。近年来,核转录因子（transcription factor NuclearFactor-Erythroid-2-related factor 2,Nrf2）在调控氧化应激中所起的作用受到越来越多的关注。作为锌指蛋白（bZIP）Cap’n’Collar家族中的一员,在激活很多编码抗氧化酶和Ⅱ相代谢酶表达的过程中起着重要的调控作用,其调控作用通过抗氧化物反应元件（antioxidant responseelements,ARE）实现。在激活Nrf2的外源性同类物中,CUR的激活效应受到了广泛关注。本研究拟选用新生大鼠星形胶质细胞（astrocytes,AST）建立氧化应激神经细胞损伤模型,并以姜黄素为干预物,拟从细胞活力、细胞毒性、氧化应激、能量代谢等几方面,探究CUR对AN所致AST损伤的保护作用及其相关机制,为探讨AN神经毒作用机制提供生化基础,为AN职业防护保健食品的开发提供实验依据。同时也为姜黄素防治神经退行性疾病及神经毒性化学物职业接触人群的化学防护提供参考。研究方法:进行大鼠AST原代培养,随机分为空白对照组,溶剂对照组,AN染毒组（1.0mmol/L处理12h）和不同浓度CUR预处理组（2umol/L、5umol/L、10umol/L、20umol/L）。MTT比色法检测细胞活力;LDH（lactate dehydrogenase）漏出试验检测细胞毒性;生化实验观察氧化应激指标丙二醛（malondialdehyde,MDA）和谷胱甘肽（glutathione,GSH）含量,过氧化氢酶（catalase,CAT）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活性;以荧光素DCF-DA为探针采用流式细胞术（FCM）和微孔板荧光酶标仪检测细胞内ROS含量;应用细胞色素C还原法检测细胞色素C氧化酶（CycOx）的活性;采用免疫细胞化学荧光法直接观察Nrf2定位,并将细胞核、浆分离后Wlesternblot评价Nrf2核转位情况;采用Western Blot检测Nrf2,Keap1,HO-1和γ-GCS蛋白表达变化;RT-PCR检测Nrf2、HO-1和γ-GCS基因在转录水平上的表达变化。研究结果:1)与空白细胞相比,AN染毒导致AST活力明显下降（P＜0.05）;而经CUR预处理之后,在其浓度＞5umol/L时细胞活力明显升高（P＜0.05）。2)与空白对照组细胞相比,AN单独作用后LDH漏出显著增加（P＜0.05）,而CUR预处理之后,LDH漏出显著降低（P＜0.05）,并呈现剂量依赖效应。3)与空白组相比,AN染毒后AST MDA含量显著升高（P＜0.05）,ROS生成显著增多（P＜0.05）,GSH显著下降（P＜0.05）,CAT活性明显降低（P＜0.05）,SOD活性略有下降（P＞0.05）;而CUR预处理显著抑制AN诱导MDA和ROS升高（P＜0.05）,CUR浓度＞2umol/LCUR显著抑制GSH下降（P＜0.05）,而仅有20umol/LCUR显著提高了SOD和CAT活性（P＜0.05）。4)AN染毒后CycOx酶活性明显降低,与空白组比有显著性差异（P＜0.05）,而经CUR预处理的AST,浓度为5umol/L时酶活就已显著高于AN损伤组（P＜0.05）,且随着CUR剂量的增加酶活升高的趋势越来越明显,渐渐恢复到正常细胞水平。5)免疫荧光结果显示,AN损伤AST后,Nrf2核转位略有增加与空白对照相组比（P＞0.05）;而经10umol/LCUR预处理之后,Nrf2由胞质大部分进入胞核（P＜0.05）,Western blot结果也发现CUR上调Nrf2蛋白表达,并且RT-PCR结果也显示Nrf2 mRNA表达增加。然而Keap1蛋白并未见明显变化。6)RT-PCR结果显示与空白组比,AN损伤的AST Nrf2下游的Ⅱ相解毒酶基因和抗氧化酶基因γ-GCS和HO-1mRNA表达略有升高（P＞0.05）,但经CUR预处理以后,随着CUR剂量的升高mRNA表达也逐渐增加,在浓度＞5umol/L时呈现出显著的统计学差异（P＜0.05）。同时免疫印迹结果显示,AN染毒略微上调γ-GCS和HO-1蛋白表达（P＞0.05）,而CUR预处理浓度＞5umol/L便显著上调了这两种蛋白的表达（P＜0.05）。结论:姜黄素能够显著的提高星形胶质细胞的细胞活力,减轻细胞毒性,提高抗氧化酶活性,降低脂质过氧化程度,抑制丙烯腈诱导的ROS生成。姜黄素能够增强Nrf2蛋白表达,并提高其基因转录水平,但对Keap1没有明显影响,最终显著促进Nrf2核转位,并激活其下游抗氧化酶基因HO-1和Ⅱ相代谢酶基因γ-GCS的mRNA表达以及上调HO-1和γ-GCS蛋白表达水平。姜黄素对丙烯腈损伤的星形胶质细胞具有保护作用,并呈剂量依赖性,其作用机制可能与激活Nrf2-ARE通路相关。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 丙烯腈的神经毒性
• 1.2 姜黄素的药理作用
• 1.3 Nrf2-Keap1-ARE通路
• 1.4 研究目的和意义
• 第二章 AST的原代培养和AN毒作用特征
• 第一节 大鼠AST的原代培养和鉴定
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 1.3 实验结果
• 第二节 AN毒作用的时间和剂量效应特征
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.3 实验结果
• 讨论
• 本章小结
• 第三章 CUR对AN损伤AST的保护作用评价
• 第一节 CUR对AN损伤的AST活力和毒性的保护
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 1.3 实验结果
• 1.4 本节小结
• 第二节 CUR对AN诱导AST氧化应激的影响
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.3 实验结果
• 第三节 CUR对AN损伤的AST ROS产生的影响
• 3.1 实验材料
• 3.2 实验方法
• 3.3 实验结果
• 第四节 CUR对AN损伤AST CycOx的影响
• 4.1 实验材料
• 4.2 实验方法
• 4.3 实验结果
• 4.4 本节小结
• 讨论
• 本章小结
• 第四章 CUR对AN损伤AST的保护机制研究
• 第一节 CUR对Nrf2核转位的影响
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 1.3 实验结果
• 第二节 CUR对AN损伤AST keap1的影响
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.3 实验结果
• 第三节 CUR对AN损伤AST Nrf2的影响
• 3.1 实验材料
• 3.2 实验方法
• 3.3 实验结果
• 第四节 CUR对AN损伤AST HO-1&γ-GCS的影响
• 4.1 实验材料
• 4.2 实验方法
• 4.3 实验结果
• 讨论
• 本章小结
• 第五章 研究总结和展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士研究生学位期间发表的论文
• 综述