糜酶抑制剂对实验性大鼠肝纤维化的影响

论文摘要

研究背景及目的:肝纤维化是诸多肝病发展为肝硬化的必由之路,也是慢性肝炎、肝硬化等进一步发展恶化的重要原因。其特征是以胶原为主的细胞外基质(ECM)因合成增加或/和降解减少而在肝内的过量沉积。肝纤维化为一动态的过程,是可逆的。但若肝纤维化进一步发展导致肝小叶结构改变和假小叶形成,即进入肝硬化阶段则难以逆转。目前,临床上尚没有非常有效的抗肝纤维化药物,肝纤维化的预防和治疗在今后一定时期仍是国内外研究的热点及难点问题之一。糜酶是糜蛋白酶的一种,属于丝氨酸蛋白酶,主要存在于肥大细胞的分泌颗粒和细胞间质中。近年来发现肥大细胞激活后可释放糜酶到ECM发挥如下作用:协同组胺发挥前炎症因子效应;参与胶原酶的激活;参与调节ECM的形成;促使组织中的血管紧张素Ⅰ(AngⅠ)转化为血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)。已有研究显示,糜酶在心脏、肾脏及肺的纤维化中均起重要作用。糜酶抑制剂可改善心脏纤维化。人体肝组织中也有肥大细胞,而肥大细胞中存在着糜酶。初步研究发现肝纤维化程度不同的慢性肝炎患者肝组织中糜酶浓度有明显差异。推测糜酶可能也参与了肝脏纤维化的形成。如果糜酶参与肝纤维化的形成,那么,在肝纤维化发生时给予糜酶抑制剂进行干预,则会减轻肝纤维化的形成而发挥治疗作用。为了证明上述科学假设,进一步证明糜酶在肝纤维化中的作用并为抗肝纤维化治疗寻找新的靶点和药物,我们进行了本项研究。方法:30只雄性Wistar大鼠随机平分为正常组、模型组及干预组。干预组及模型组均腹腔内注射1%二甲基亚硝胺(DMN)(10mg/kg,3次/周,共4周)用作肝纤维化造模;正常组注射等体积生理盐水。干预组同时给,予糜酶抑制剂(SBTI)灌胃(10mg/kg,1次/日,共四周):模型组及正常组则以等剂量生理盐水灌胃。4周末麻醉大鼠,取心脏血,称量肝、脾湿重并收取肝组织;苏木精—伊红染色(HE染色)和Masson染色观察肝纤维化的形成;随机抽取样本透射电镜下观察肝细胞超微结构改变;酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、Ⅳ型胶原(CⅣ);放射免疫分析法(RIA)测定肝组织内糜酶活性。结果:①正常组、模型组和干预组大鼠体重分别为326.2±15.1g、279.2±15.8g和321.6±19.3g;肝湿重分别为10.60±0.95g、12.53±1.09g和10.91±0.58g;脾湿重分别为0.90±0.06g、1.20±0.17g和1.00±0.12g;肝、脾指数分别为(3.25±0.22%,0.28±0.03%)、(4.48±0.22%,0.43±0.05%)和(3.63±0.11%,0.31±0.03%)。与正常组相比,模型组大鼠体重明显降低(P＜0.05),肝、脾湿重及肝、脾指数均明显增加(P＜0.05);干预组大鼠体重和肝、脾湿重及脾指数与正常组相比无明显变化(P＞0.05),肝指数明显增加(P＜0.05)。与模型组相比,干预组大鼠体重明显增加,肝、脾湿重及肝、脾指数均明显降低(P均＜0.05)。②组织病理学观察,HE染色及Masson染色示正常组大鼠肝小叶结构正常,肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列,肝细胞无变性坏死。模型组大鼠肝小叶结构明显破坏,纤维结缔组织明显增生并向小叶内延伸,假小叶形成,汇管区炎性浸润明显。干预组大鼠肝小叶结构轻度紊乱,汇管区仅见少量炎性细胞浸润,无明显假小叶形成。干预组肝内炎症活动度分级及纤维化程度分期较模型组明显改善(P＜0.05)。③透射电镜显示干预组大鼠肝细胞损害较模型组明显减轻,细胞器结构清晰完整与正常组相似,胶原纤维较少,但胶原纤维稍多于正常组。④干预组大鼠血清肝纤维化四项指标(HA 165.6±14.8ng/mL、LN 102.4±11.4ng/mL、PCⅢ172.8±13.μg/L和CⅣ69.6±7.3μg/L)稍高于正常组(分别为102.5±14.1ng/mL、97.2±13.5ng/mL、90.6±16.3μg/L和38.4±5.7μg/L),P分别＜0.05、＞0.05、＜0.05、＜0.05。但是,与模型组相比(分别为198.6±16.3ng/mL、116.9±13.4ng/mL、201.6±12.7μg/L、84.3±6.9μg/L),干预组血清肝纤维化四项均明显降低(P均＜0.05)。⑤糜酶活性检测显示,干预组大鼠肝组织糜酶活性(0.216±0.018U/mg蛋白)高于正常组(0.165±0.051U/mg蛋白),但显著低于模型组(0.288±0.089U/mg蛋白)(P＜0.05)。结论:①糜酶抑制剂可显著降低实验性肝纤维化大鼠肝组织内糜酶活性,因而减少局部AngⅡ的生成;②糜酶抑制剂能降低大鼠血清HA、LN、PCⅢ及CⅣ水平,改善肝组织炎症活动度分级及纤维化程度分期;③糜酶抑制剂对肝细胞有一定的保护作用。糜酶参与实验性大鼠肝纤维化的形成和肝脏炎症过程,而糜酶抑制剂有可能发展为新的抗肝纤维化药物。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 附表
• 附图
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间撰写及发表的论文
• 学位论文评阅及答辩情况