朝藿定c对小鼠巨噬细胞的调节和脑缺血/再灌注损伤的保护作用

论文摘要

目的研究朝藿定c（Epimedinc, EPIc）对小鼠巨噬细胞的调节功能和脑缺血再灌注损伤小鼠的影响,并对相关机制做了初步探讨。方法1.腹腔巨噬细胞的研究主要集中在以下几个方面：MTT法和CCK-8法检测EPIc对腹腔巨噬细胞的药物毒性作用；显微拍照研究EPIc对腹腔巨噬细胞长期存活的影响；Sytox（?）Green染色,荧光酶标仪检测EPIc对放线菌酮（CHX）,环磷酰胺（CTX）,H2O2诱导的细胞凋亡的影响；MitoTracker（?）red/Calcein-AM染色和LysoTracker（?） red/FluoAM染色,激光共聚焦显微镜检测EPIc对腹腔巨噬细胞线粒体和溶酶体的影响；通过活细胞染料DIOC6（3）标记活的腹腔巨噬细胞,激光共聚焦显微镜下观察EPIc对巨噬细胞粘附功能的影响；Griess Rragent试剂盒检测EPIc对腹腔巨噬细胞NO释放的影响；mouse IL-1β的Elisa试剂盒检测EPIc对腹腔巨噬细胞IL-1β释放的影响；利用Cytometric Bead Array （CBA）方法检测EPIc对细胞因子IL-6、IL-10、MCP-1、IFN-γ和TNF释放的影响；激光共聚焦显微镜检测EPIc对腹腔巨噬细胞吞噬荧光标记的E.coli的影响；利用流式细胞仪检测EPIc对腹腔巨噬细胞吞噬荧光微球（Fluorescent bead）的影响。2.对脑中巨噬细胞-小胶质细胞的研究主要集中在：利用X-Celligence RTCA系统检测EPIc对长期培养的小胶质细胞存活指数的影响；利用X-Celligence RTCA系统检测EPIc对H2O2诱导的小胶质细胞凋亡的影响；利用离子酶素（Ionomycin, ION）将小胶质细胞外的Ca2+转运到细胞内,引起小胶质细胞胞浆内[Ca2+]i的积累,激光共聚焦显微镜和X-Celligence RTCA系统分别检测EPIc对小胶质细胞胞浆内[Ca2+]i的过载导致的小胶质细胞凋亡的影响；利用活细胞染料DIOC6（3）染色检测EPIc对小胶质细胞活化及Nano-tubes （NTs）产生的影响；利用激光共聚焦扫描显微镜研究EPIc对小胶质细胞核因子（NF-kappa B, NF-κB）转位的影响。3.对神经细胞和脑缺血／再灌注模型小鼠的研究主要在以下方面：激光共聚焦扫描显微镜检测EPIc对ION转运引起的胞浆内Ca2+过载导致的神经细胞凋亡的作用；利用脑切片的TTC染色,检测脑缺血／再灌注损伤模型小鼠脑梗死面积,以确定EPIc对脑缺血／再灌注损伤模型小鼠的脑组织活性的影响；利用干／湿重比例法,检测脑缺血／再灌注损伤模型小鼠的脑含水量,以研究EPIc对模型小鼠的脑水肿程度的影响；通过对大量脑缺血／再灌注损伤模型小鼠长期饲养,检测EPIc对脑缺血／再灌注损伤模型小鼠寿命的影响。结果1.EPIc对腹腔巨噬细胞的调节作用：MTT法和CCK-8法检测结果显示EPIc对腹腔巨噬细胞在设定的浓度范围内没有细胞毒性；通过显微拍照发现EPIc能够促进腹腔巨噬细胞的长期存活；Sytox Green染色结果证明EPIc能抑制CHX、CTX和H202诱导的腹腔巨噬细胞的凋亡；MitoTracker（?） red TM/Calcein-AM染色和LysoTracker（?） red染色,激光共聚焦显微镜检测结果显示：EPIc能够保护长期培养的腹腔巨噬细胞的线粒体的完整性,抑制其解体；能抑制ION引起的腹腔巨噬细胞内Ca2+过载导致的溶酶体解体,进一步抑制了腹腔巨噬细胞的凋亡；DIOC6（3）染色检测结果显示：EPIc能够促进腹腔巨噬细胞的粘附；Griess Rragent试剂盒检测结果显示EPIc能够促进静止状态下腹腔巨噬细胞释放NO,而抑制LPS刺激的腹腔巨噬细胞NO的产生；mouse IL-1β的Elisa试剂盒检测结果显示：EPIc促进静止状态下腹腔巨噬细胞释放IL-1p,而抑制LPS刺激的腹腔巨噬细胞的IL-1β的产生；CBA检测结果显示：EPIc能够促进静止状态下腹腔巨噬细胞释放IL-6、IL-10、MCP-1、IFN-γ和TNF,而抑制LPS刺激的腹腔巨噬细胞的IL-6、IL-10、MCP-1、IFN-γ和TNF的产生；激光共聚焦显微镜和流式细胞仪对腹腔巨噬细胞吞噬功能检测结果均显示：EPIc能够促进腹腔巨噬细胞的吞噬功能。2.EPIc对小胶质细胞的调节作用的研究：通过X-Celligence RTCA系统对小胶质细胞的存活指数的动态追踪发现,EPIc对小胶质细胞在设计的浓度范围内没有任何的药物毒副作用；EPIc能够抑制H202诱导的小胶质细胞的凋亡；能够抑制或者延缓ION引起的小胶质细胞胞浆内Ca2+过载导致的细胞凋亡；EPIc能够促进小胶质细胞NTs的产生,进而促进小胶质细胞之间的信息交流；EPIc对小胶质细胞的NF-κB的转位具有双向调节作用,能够促进静止状态下小胶质细胞NF-κB的转位,抑制LPS刺激的小胶质细胞的NF-κB的转位。3.对脑缺血再灌注模型小鼠的研究结果：EPIc能够抑制ION引起的神经细胞胞浆内[Ca2+]i过载导致的神经细胞的凋亡作用；EPIc能够明显减少脑缺血／再灌注损伤模型小鼠的脑坏死面积的比例；能够减少脑缺血／再灌注损伤模型小鼠的脑含水量,从而抑制脑水肿程度；能够明显延长脑缺血／再灌注损伤模型小鼠的寿命。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 一.朝藿定c的研究进展
• 二.巨噬细胞的概述
• 三.脑缺血再灌注的病理生理研究
• 四.脑缺血再灌注损伤与免疫系统的关系
• 五.课题设计的思想和意义
• 参考文献
• 第一章 EPIc对小鼠腹腔巨噬细胞的调节作用
• 引言
• 材料和方法
• 1 实验材料
• 2 方法
• 结果
• 1 EPIc对腹腔巨噬细胞药物毒性结果
• 1.1 MTT法检测EPIc对腹腔巨噬细胞的药物毒性
• 1.2 CCK-8试剂盒检测EPIc对腹腔巨噬细胞的药物毒性作用
• 2 EPIc对腹腔巨噬细胞存活的影响
• 2.1 倒置显微镜下观察EPIc对腹腔巨噬细胞存活的影响
• Green染色,荧光酶标仪检测EPIc对CHX、CTX及H₂O₂诱导的腹巨噬细胞凋亡的影响'>2.2 Sytox^Green染色,荧光酶标仪检测EPIc对CHX、CTX及H₂O₂诱导的腹巨噬细胞凋亡的影响
• 3 EPIc对腹腔巨噬细胞保护作用机制的研究
• 3.1 EPIc对腹腔巨噬细胞线粒体的影响
• 3.2 EPIc对腹腔巨噬细胞溶酶体的作用
• 4 EPIc对腹腔巨噬细胞功能的研究
• 4.1 EPIc对腹腔巨噬细胞粘附功能的研究
• 4.2 EPIc对腹腔巨噬细胞释放NO的影响
• 4.3 EPIc对腹腔巨噬细胞细胞因子释放的影响
• 4.3.1 EPIc对腹腔巨噬细胞IL-1β释放的影响
• 4.3.2 EPIc对腹腔巨噬细胞IL-6、IL-10、MCP-1、IFN-γ及TNF释放的影响
• 4.4 EPIc对腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响
• 4.4.1 激光共聚焦显微镜检测EPIc对E.coli的吞噬功能的影响
• 4.4.2 流式细胞仪检测EPIc对腹腔巨噬细胞吞噬荧光微球功能的影响
• 讨论
• 参考文献
• 第二章 EPIc对小胶质细胞的调节作用
• 引言
• 材料与方法
• 1 材料
• 2 方法
• 结果
• 1 X-Celligence RTCA系统检测EPIc对小胶质细胞长期存活的影响
• 2O₂诱导的小胶质细胞凋亡的影响'>2 X-Celligence RTCA系统检测EPIc对H₂O₂诱导的小胶质细胞凋亡的影响
• 2+过载导致的小胶质细胞凋亡的影响'>3 EPIc对ION引起的胞浆内Ca²⁺过载导致的小胶质细胞凋亡的影响
• 2+过载导致的小胶质细胞凋亡的影响'>3.1 X-Celligence RTCA系统检测EPIc对ION引起的胞浆内Ca²⁺过载导致的小胶质细胞凋亡的影响
• AM/DAPI染色,LSCM检测EPIc对ION引起的胞浆内Ca²⁺过载导致的小胶质细胞凋亡的影响'>3.2 Fluo-4^AM/DAPI染色,LSCM检测EPIc对ION引起的胞浆内Ca²⁺过载导致的小胶质细胞凋亡的影响
• 6（3）染色,LSCM检测EPIc对小胶质细胞形态及活性的影响'>4 DIOC₆（3）染色,LSCM检测EPIc对小胶质细胞形态及活性的影响
• 5 EPIc对小胶质细胞NF-κB转位的影响
• 讨论
• 参考文献
• 第三章 EPIc对脑缺血/再灌注损伤模型小鼠的作用
• 引言
• 材料与方法
• 1 实验材料
• 2 方法
• 结果
• AM/DAPI染色,LSCM检测EPIc对胞浆内Ca²⁺过载导致的神经细胞凋亡的影响'>1 Fluo-4^AM/DAPI染色,LSCM检测EPIc对胞浆内Ca²⁺过载导致的神经细胞凋亡的影响
• 2 神经学功能评分及最佳药剂量的确定
• 3 TTC染色检测模型小鼠的脑坏死面积
• 4 EPIc对MCAO小鼠脑含水量（Brain Water Content,BWC）的影响
• 5 EPIc对MCAO/R模型小鼠寿命的影响
• 讨论
• 参考文献
• 小结
• 未来实验计划
• 创新点
• 英文缩略词
• 学术期间发表论文
• 致谢