苏云金芽胞杆菌sigL基因功能的研究

论文摘要

苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）因其杀虫效果好、安全、高效等优点而成为农业生物防治上应用最为广泛的杀虫微生物。与其它芽胞杆菌相比,Bt的显著特点就是在形成芽胞的同时,还能产生由杀虫蛋白组成的伴胞晶体。Cry蛋白从开始表达到晶体和芽胞的最终成熟涉及很多的物质和能量代谢,与其它芽胞杆菌相比,在苏云金芽胞杆菌晶体和芽胞形成过程中,与代谢相关的酶的合成和活性调节可能存在更为精细的方式。sigL基因编码的产物σL是细菌中调控许多重要代谢途径的sigma因子,本文围绕苏云金芽胞杆菌中的sigL基因的功能进行了一系列的研究,主要内容包括:克隆了Bt HD-73菌株的sigL基因,通过核苷酸序列同源性比对分析发现,在蜡样芽胞杆菌群（Bacillus cereus group）中具有较高的相似性,而与枯草芽胞杆菌的相似性较低,为43%。氨基酸序列分析表明,sigL基因属于σ54家族。应用同源重组的方法构建了Bt HD-73菌株的sigL基因插入失活突变菌株,并构建了相应的互补菌株,对sigL基因的功能进行了研究。在营养成分丰富的培养基中,sigL突变体的生长速率明显比出发菌株低,说明sigL基因的缺失影响了菌体对培养基中营养成分的利用,sigL基因在Bt HD-73菌株中是重要的调控代谢途径的σ因子。比较了出发菌株与sigL突变菌株在不同氮源培养基中的生长情况,差异显著性分析表明,sigL基因的缺失导致菌体不能利用精氨酸、脯氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸为唯一的氮源。SDS-PAGE和芽胞计数分析表明,sigL基因的缺失推迟了HD-73菌株杀虫晶体蛋白产生的时间,降低了芽胞的产量。在已公布的Bt 97-27库斯塔克亚种全基因组序列中找到了5个依赖于σL的转录调节因子（AcoR、BkdR、Bt104、LevR、Reg）,在HD-73菌株中构建了这些转录调节因子的启动子与lacZ融合表达质粒,通过β-半乳糖苷酶活性分析表明,这5个基因的启动子在sigL突变体中的活性比在Bt HD-73菌株中的活性低;蛋白结构域分析表明,这5个转录调节因子的蛋白结构域具有依赖于σ54的转录调节因子的结构特点;序列比对分析表明,这些转录调节因子所在的操纵子的启动子序列具有受sigL调控的-12/-24区的特点,以上的结果说明Bt中的这些转录调节因子是依赖于σL的转录调节因子。研究了sigL基因对γ-氨基丁酸（GABA）代谢途径的调控,构建了GABA代谢途径中gabT基因（编码γ-氨基丁酸转氨酶）的启动子与lacZ融合表达质粒,通过β-半乳糖苷酶活性分析表明,gabT基因受sigL基因和reg基因的正调控,并且gabT基因的启动子是-12/-24区的特点。说明苏云金芽胞杆菌中的GABA代谢途径受σL调控。通过对sigL基因的功能研究,有助于了解苏云金芽胞杆菌的发育过程中能量和物质代谢调节机制,揭示该σ因子在晶体形成等生理生化过程中的功能和作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 苏云金芽胞杆菌概述
• 1.2 苏云金芽胞杆菌伴胞晶体形成的生理生化机制
• 1.2.1 营养因素
• 1.2.2 代谢模式
• 1.2.3 环境因素
• 1.3 原核生物Sigma54 因子的研究进展
• 54 的结构特点及作用机制'>1.3.1 σ⁵⁴的结构特点及作用机制
• 54 的转录调节因子（EBPs）'>1.3.2 依赖于σ⁵⁴的转录调节因子（EBPs）
• 1.3.3 受σ54 调控的基因的生理功能
• 1.4 立题依据与目的意义
• 1.4.1 立题依据
• 1.4.2 目的意义
• 2 实验材料、仪器与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 培养基与抗生素
• 2.1.3 酶与生化试剂
• 2.1.4 溶液与缓冲液
• 2.2 实验仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 PCR 模板制备
• 2.3.2 Bt 总DNA 提取
• 2.3.3 目的基因的扩增
• 2.3.4 Taq 加“A”碱基反应体系
• 2.3.5 酶切反应
• 2.3.6 琼脂糖凝胶电泳
• 2.3.7 DNA 的回收
• 2.3.8 DNA 片段的连接
• 2.3.9 大肠杆菌JM110 热激感受态细胞制备
• 2.3.10 大肠杆菌的热激转化
• 2.3.11 大肠杆菌SC5110 电击感受态细胞制备
• 2.3.12 大肠杆菌的电击转化
• 2.3.13 Bt 电击感受态细胞制备
• 2.3.14 Bt 菌株的电击转化
• 2.3.15 重组质粒的提取
• 2.3.16 重组质粒的鉴定
• 2.3.17 基因序列的测定及分析
• 2.3.18 氨基酸序列同源性分析
• 2.3.19 同源重组突变体的获得
• 2.3.20 Southern 杂交
• 2.3.21 Bt 菌株生长曲线的测定
• 2.3.22 SDS-PAGE 电泳
• 2.3.23 活芽胞记数
• 2.3.24 β-半乳糖苷酶酶活分析
• 3 结果与分析
• 3.1 sigL 基因的鉴定与序列分析
• 3.2 sigL 基因插入失活突变株的构建与鉴定
• 3.2.1 sigL 基因插入失活片段的构建
• 3.2.2 sigL 基因突变质粒的构建与鉴定
• 3.2.3 sigL 基因突变体的筛选与验证
• 3.3 sigL 基因互补菌株的构建与筛选
• 3.4 出发菌株、突变菌株、互补菌株生长性状的比较
• 3.4.1 出发菌株、突变菌株、互补菌株生长速度的比较
• 3.4.2 出发菌株、突变菌株、互补菌株晶体蛋白的比较
• 3.4.3 出发菌株、突变菌株、互补菌株芽胞产量的比较
• 3.4.4 不同氮源条件下，出发菌株与突变菌株的生长情况
• 3.5 依赖于σL 的转录调节因子的启动子活性分析
• 3.5.1 acoR 基因启动子与lacZ 融合表达质粒的构建与活性分析
• 3.5.2 Bt104 基因启动子与lacZ 融合表达质粒的构建与活性分析
• 3.5.3 bkdR 基因启动子与lacZ 融合表达质粒的构建与活性分析
• 3.5.4 levR 基因启动子与lacZ 融合表达质粒的构建与活性分析
• 3.5.5 reg 基因启动子与lacZ 融合表达质粒的构建与活性分析
• 3.6 依赖于σL 的转录调节因子的蛋白结构域分析
• 3.7 sigL 基因对γ-氨基丁酸代谢途径的影响
• 3.7.1 gabT 基因启动子与lacZ 融合表达质粒的构建与活性分析
• 3.7.2 GABA 培养基中出发菌株与突变菌株生长情况的比较
• 4 讨论
• 4.1 sigL 基因对苏云金芽胞杆菌生长代谢的重要性
• 4.2 sigL 基因在Bt 中可能调控的代谢途径
• 4.3 GABA 代谢途径相关的生物合成基因簇
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文