B细胞淋巴瘤Fab噬菌体抗体库的构建、筛选及鉴定

论文摘要

目的:噬菌体抗体库技术是应用基因克隆方法把全套抗体基因呈现在噬菌体表面,通过抗原的亲和力选择和噬菌体扩增获得特异性抗体基因。利用该技术可制备出多种特异性单克隆抗体片段,包括Fab、ScFv、dsFv及diabody。本研究旨在运用噬菌体抗体库技术构建针对B细胞淋巴瘤Raji细胞系噬菌体抗体库并从中筛选出特异性的Fab抗体。方法:以Raji淋巴瘤细胞免疫BALB/c小鼠,ELISA检测抗血清滴度后,分离抗体阳性的小鼠脾淋巴细胞,提取总RNA。利用RT-PCR扩增抗体轻链κ基因和重链Fd段,经SacI/XbaI和XhoI/SpeI双酶切,依次克隆入噬菌体载体pComb3H-SS的相应酶切位点,并电转化大肠杆菌XL1-Blue,以辅助噬菌体VCSM13进行超感染,构建B细胞淋巴瘤Raji细胞系Fab噬菌体抗体库。将Raji细胞包被6孔板,对噬菌体抗体库进行5轮“吸附—洗脱—扩增”富集筛选。随机挑选最后一轮富集筛选的单克隆在大肠杆菌XL1-Blue中进行可溶性表达,通过ELISA法进行抗原结合活性测定,对所获得的阳性克隆进一步作基因序列测定,并用Western blot对表达产物的特异性作了鉴定。结果:（1）RT-PCR扩增的各亚类IgG的Fd基因和轻链κ基因,经1.5%琼脂糖凝胶电泳,均可扩增出大小约700 bp的条带,与预期长度相符。（2）Fab抗体库的构建分两步。第一步,将各轻链κ基因扩增片段混合、酶切、纯化及与线状载体pComb3H-SS连接后,电转化XL1-Blue菌,成功构建轻链κ基因文库,铺板测定转化子数为4.5×107,SacI/XbaI酶切鉴定其重组率为100%,则实际所构建的轻链κ抗体库容量为4.5×107。第二步,将轻链κ基因文库扩增并抽提质粒（命名为pComb3H-S+κ）,XhoI/SpeI酶切、纯化后,与经相同处理的重链Fd段混合、连接、电转化XL1-Blue菌,成功构建Fab基因文库,铺板测定其转化子数为3.5×107,经XhoI/SpeI酶切鉴定,重链Fd段的重组率为78%,再经SacI/SpeI酶切鉴定,Fab重组率为86%,故所构建的Fab噬菌体抗体原始库容量为3.5×107×78%×86%=2.35×107。（3）以Raji细胞为固相抗原对经辅助噬菌体VCSM13超感染的噬菌体抗体库进行5轮“吸附—洗脱—扩增”富集筛选,每轮筛选后抗体库的噬菌体投入产出比逐渐增高,说明携带的抗Raji细胞膜抗原的噬菌体抗体得到明显富集,当筛选至第5轮时,噬菌体投入产出比较第1轮提高240倍。从中挑取65个单克隆制备成可溶性Fab抗体,经ELISA检测获得与Raji细胞系特异性结合的8株阳性克隆。对其中2株阳性克隆进行基因测序分析,结果显示轻链κ可变区氨基酸序列与GenBank中已注册的鼠源性免疫球蛋白轻链κ可变区氨基酸序列同源性均达94%,重链Fd段与GenBank中已注册的鼠源性免疫球蛋白重链可变区氨基酸序列同源性分别为89%和92%。Westernblot结果表明所获得阳性克隆的可溶性表达产物可与Raii细胞膜抗原特异性结合。结论:我们应用噬菌体表面呈现技术成功构建了抗B细胞淋巴瘤Raji细胞系的Fab噬菌体抗体库,由此筛选和鉴定出针对Raji细胞系膜抗原的抗体,为进一步研究B细胞淋巴瘤的免疫治疗奠定了实验基础。

论文目录

• 中文提要
• Abstract
• 引言
• 实验流程
• 第一部分 Raji细胞免疫的鼠脾淋巴细胞抗体基因的扩增
• 1.材料
• 2.方法
• 3.结果
• 4.讨论
• 第二部分 B细胞淋巴瘤Fab噬菌体抗体库的构建
• 1.材料
• 2.方法
• 3.结果
• 4.讨论
• 第三部分 B细胞淋巴瘤Fab噬菌体抗体库的筛选
• 1.材料
• 2.方法
• 3.结果
• 4.讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 研究生期间学术成果
• 缩略语表
• 致谢
• 详细摘要