论文摘要
本论文的第一部分是Man2c1基因表达抑制经有丝分裂阻滞及凋亡诱导抑制食管癌细胞生长。本实验室于2000年克隆到了人α-甘露糖苷酶Man2c1 cDNA,GenBank登记号为AF044414,此cDNA长3123 bp,编码产生的α-甘露糖苷酶长1040 aa,分子量在去糖基化状态下为116 kDa。鞠吉雨师兄用腺病毒介导的RNAi技术抑制Man2c1基因在人食道癌细胞株EC9706的表达,得到两株Man2c1基因表达显著抑制的EC9706细胞（B7和D2）。我们研究发现,B7和D2细胞在体外培养中的生长和集落形成明显抑制,它们接种裸鼠皮下的成瘤性生长明显减慢。流式细胞仪分析见细胞在S和G2/M期聚集,并出现sub-G0/G1峰,提示细胞发生凋亡。我对此现象的机制进行了探讨。我首先分析了细胞的有丝分裂状况,见与对照细胞相比,B7和D2细胞的有丝分裂阻滞于M检验点。由于真核细胞的很多重要功能如细胞分裂均依赖细胞骨架,我用抗α-tubulin单抗免疫荧光染色细胞骨架,显示B7和D2细胞的微管结构变得模糊,并且在核周聚集,有些细胞还有长的胞质性突起。用抗α-tubulin单抗作Western印迹检测,见B7和D2细胞中聚合的α-tubulin减少。这些数据显示,Man2c1抑制导致EC9706细胞恶性生物学行为减弱的可能机制之一是,α-tubulin聚合受阻,影响微管重排,导致细胞有丝分裂阻滞,从而诱发凋亡。E-cadherin-catenin复合物表达增加在Man2c1抑制导致EC9706细胞恶性生物学行为减弱中可能也起作用。本论文的第二部分是8B7血影蛋白的细胞内定位与功能研究。8B7 cDNA是本实验室从人扁桃体细胞λgt11 cDNA文库克隆得到的一个cDNA,GenBank登记号为AF043290。8B7 cDNA长1835 bp,88-1179 bp为开放阅读框,编码363个氨基酸的蛋白质分子。因为从8B7 cDNA推断的编码蛋白质含有血影蛋白重复序列（spectrin repeat,SPEC）,我们将其编码蛋白质命名为8B7血影蛋白。8B7血影蛋白是Nesprin蛋白家族的1个新成员。Blast分析显示,8B7 cDNA与Enaptin cDNA、Nesprin-1 cDNA、Myne-1 cDNA及Syne-1 cDNA的3’端1835bp核苷酸序列100%同源,8B7血影蛋白与Enaptin蛋白、Nesprin-1蛋白、Myne-1蛋白及Syne-1蛋白的C末端363个氨基酸序列100%同源。已发现的Nesprin蛋白家族成员有Syne-1、Syne-2、Nesprin-1、Nesprin-2、Myne-1、Myne-2、Enaptin和Nuauce等20余种,这些成员都是nesprin-1 giant和nesprin-2 giant基因变位剪接的产物。8B7是由nesprin-1 giant的第141到147个外显子编码产生的。本实验室以往的Northern印迹检测显示了8B7 cDNA存在于人组织中。本人制备了抗8B7血影蛋白的单抗,用此单抗作探针,Western印迹检测表明了此蛋白存在于人细胞中。Nesprin蛋白家族成员含有KASH结构域和肌动蛋白结合结构域,主要定位在核膜,在核内、胞浆和细胞器中也有广泛分布。8B7血影蛋白小,缺如N末端的肌动蛋白结合结构域,只有C末端的KASH结构域和两个血影蛋白重复序列。8B7血影蛋白在核膜的定位表明,是KASH结构域决定了8B7血影蛋白在细胞内的定位。已发现的定位于核膜的Nesprin蛋白家族成员的功能包括:参与核膜的崩解和重建;参与胞质分裂;参与细胞骨架的构建与调节;与内核膜蛋白及异染色质交联,可能在核膜形成一个复合物,通过桥联将细胞核和细胞骨架结构连接起来。刘荣师姐曾利用酵母双杂交技术筛选到可能与8B7血影蛋白相互作用的30余种蛋白质。我藉免疫共沉淀检测了8B7血影蛋白与Dynactin（P62）、Stathmin、Emerin及LaminA间的关系,结果只见8B7和LaminA可以在体外共沉淀。Lamin A是核纤层的组成成分,由LMNA基因编码,是核内许多蛋白分子的共同锚定物,在维持核膜的正常形态,提供染色质的锚定位点以及在核的重组过程中可能发挥重要作用。8B7血影蛋白可能经由Lamin A发挥功能。