论文摘要
作为治疗糖尿病的药物,重组人胰岛素基因曾先后在大肠杆菌和酿酒酵母S. cerevisiae中表达,但由于大肠杆菌和酿酒酵母自身的缺陷,表达量受到限制。甲醇酵母Pichia pastoris是近年发展起来的真核表达系统,胰岛素原基因已在Pichia pastoris中进行了成功的分泌表达。由于其表达量高,具有翻译后成熟的蛋白修饰等优点而日益受到人们的重视。 将小C肽人胰岛素原（B-Arg-Arg-Lys-Arg-A）基因插入到甲醇酵母Pichia pastoris的分泌表达质粒pPIC9中,得到含胰岛素基因的分泌表达质粒I-pPIC9并电转化p.pastoris GSll5（his4）。筛选出整合型His+Mut+菌株,然后进一步筛选得到高拷贝转化子。经1L摇瓶培养后,SDS-PAGE证明重组人胰岛素在甲醇酵母中能有效分泌表达,表达量可达到50mg/ml。将发酵液收集后用硫酸铵沉淀、DEAESephadex A-25离子柱层析等方法对目的蛋白进行纯化,可使产物中的重组人胰岛素含量由最初的15%提高到30%。 胰岛素放射免疫实验,证明重组人胰岛素具有与胰岛素标样相同的抗体结合能力;HPLC 实验证明重组人胰岛素具有与胰岛素标样基本相同的保留时间;小鼠活性实验证明重组人胰岛素具有胰岛素活性。
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