急性白血病中分泌型卷曲相关蛋白基因甲基化状态对其转录调控及Wnt信号途径的影响

论文摘要

目的应用甲基化特异性PCR （methylation specific PCR, MSP）和T-A克隆测序检测九种恶性血液病细胞株以及急性白血病患者SFRP基因的甲基化状态,筛选SFRP基因高甲基化的恶性血液病细胞株,并将其作为研究SFRP基因甲基化与表达关系的实验对象；探讨5-杂氮-2’脱氧胞苷（5-aza-2’-deoxycytidine, 5-Aza-CdR）逆转急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞株SFRP基因甲基化状态及调节转录作用及其可能的机制,同时观察SFRP基因甲基化状态逆转对Wnt信号途径及凋亡相关基因表达的影响。方法采用MSP和T-A克隆测序检测九种恶性血液病细胞株以及急性白血病患者SFRP基因的甲基化状态；采用CCK-8法检钡（?）5-Aza-CdR对Jurkat细胞系存活率的影响；Hoechst-PI荧光染色法观察细胞凋亡情况,Annexin V FITC/PI流式细胞仪检测凋亡率；MSP法检测药物作用前后SFRP基因甲基化状态变化,荧光实时定量PCR法检测（?）SFRP基因、RT-PCR检测（?）DNMT1、DNMT3A、DNMT3B以及β-cateni、survivin、c-myc、和cyclin-D1 mRNA的表达；Western-blotting鉴定β-catenin蛋白的表达变化。结果（1）经过MSP和T-A克隆测序鉴定,SFRP1、2、4、5基因启动子区异常甲基化在九种恶性血液病细胞系中广泛存在；87例AL患者中SFRP1、2、4、5甲基化总阳性率分别是35.6%、25.3%、12.6%、17.2%。（2）5-Aza-CdR作用Jurkat细胞72h后SFRP基因甲基化程度明显减弱,并且表达上调,同时甲基转移酶DNMT1、DNMT3A、DNMT3B的表达下降并呈浓度依赖性。（3）5-Aza-CdR对Jurkat细胞生长有明显的抑制作用,随药物浓度的增高,细胞凋亡比例也逐渐增加。（4）5-Aza-CdR作用Jurkat细胞72h后,Jurkat细胞中β-catenin表达明显降低,同时survivin、c-myc和cyclin-D1等表达也随药物浓度的增高而降低,与未加药组细胞比较差异有统计学意义。结论（1）SFRP1、2、4、5基因启动子区异常甲基化在恶性血液病细胞系中广泛存在,在AL患者中,SFRP1、2、4、5基因已出现高频率甲基化。（2）5-Aza-CdR在体外能够逆转Jurkat细胞中SFRP基因的高甲基化状态,从而激活SFRP基因的转录表达。（3）5-Aza-CdR在体外逆转Jurkat细胞中SFRP基因甲基化,激活转录表达的机制可能与抑制DNMT1、DNMT3A、DNMT3B有关。（4）5-Aza-CdR在体外能够明显抑制Jurkat细胞增殖,并诱导凋亡,其作用机制可能与通过抑制Wnt/β-catenin信号通路异常激活有关。

论文目录

• 英文略缩词
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 MSP对恶性血液病细胞系中SFRP基因启动子区异常甲基化状态的分析
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 急性白血病患者SFRP基因启动子区甲基化状态的检测及意义
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 5-杂氮-2’-脱氧胞苷酸诱导急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞系SFRP基因去甲基化的转录调节作用
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第四部分 5-杂氮-2’-脱氧胞苷酸对急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞凋亡及Wnt信号途径的影响
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 全文总结
• 参考文献
• 综述 Wnt信号通路在恶性血液肿瘤发生中的作用
• 攻读硕士学位期间发表论文
• 致谢