番茄红素的一种新型生产途径 ——Erwinia herbicola的crtI基因在Rhodobacter sphaeroides中表达

论文摘要

番茄红素是一种在动植物体中广泛分布的类胡萝卜素,呈红色,因最先发现于番茄而得名,分子式为C40H56,分子量为536.88。近年来国内外研究和调查表明,番茄红素具有优越的生理功能,因而在食品、化妆品以及医药领域有重要的应用。目前,番茄红素的生产工艺已成为国内外许多公司研究与开发的热点,特别是随着不同生物类胡萝卜素合成基因的相继克隆,为利用微生物发酵来获取番茄红素提供了可能。crtI基因编码八氢番茄红素脱氢酶,在不同的物种其作用有所不同。在Erwinia herbicola中,八氢番茄红素经过八氢番茄红素脱氢酶的四步脱氢作用形成番茄红素,而在光合细菌Rhodobacter sphaeroides中则经过三步脱氢作用形成链孢红素。本文介绍了,将E. herbicola中的crtI基因转化到光合细菌R. sphaeroides中异源表达,使原来不生产番茄红素的光合细菌R. sphaeroides经过改造后生产番茄红素。本研究取得的主要结果如下:1.应用结合转移的方法成功的将含有外源基因crtI的表达载体pRKR5转入光合细菌R. sphaeroides中构建工程菌。通过比较GenBank中已登录的E. herbicola家族crtI基因的氨基酸序列和核苷酸序列,根据保守序列设计简并引物,利用PCR技术,从E. herbicola069菌株基因组DNA中克隆出crtI基因的DNA序列约629bp,测序后比较发现与E. herbicola pv. Milletiae （GenBank登录号:AB076662）同源性高达95.8%;再根据E. herbicola pv. Milletiae基因序列设计全长引物,从而扩增出crtI全长基因,GenBank登录号为DQ408590;然后将crtI基因连接到含强启动子Puc的表达载体pRKR5上构建表达质粒pRKR5-crtI,通过接合转移的方式将其导入光合细菌R. sphaeroides突变株TC72中构建基因工程菌。2.通过调控氧浓度成功的诱导工程菌累积红色色素。由于启动子Puc在厌氧条件下高效表达,在工程菌培养过程中对氧浓度进行调控诱导其生产红色色素。3.经HPLC和吸收光谱分析得出工程菌中合成的色素为番茄红素,并初步计算番茄红素的含量。提取工程菌中的红色色素,采用紫外分光光度计和HPLC扫峰鉴定为番茄红素;工程菌的生物量（干重）为2.36gDCW/L,利用公式初步计算番茄红素含量为1.52mg/gDCW,与其它生产番茄红素的工程菌相比,如大肠杆菌和产朊假丝酵母,番茄红素产量有一定程度的提高。4.对工程菌和对照株的生长曲线和发酵曲线进行研究,结果发现:工程菌和对照株生长曲线极为相似,均经过3个主要时期:延迟期、生长指数期和稳定期;发酵曲线二者有很大差别:对照株番茄红素产量为零,而工程菌的番茄红素含量随时间延长显著提高,且稳定初期时达到最大值,稳定期之后,累积的番茄红素被降解,因此培养时间以达到稳定期的初期为宜。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 1 绪论
• 1.1 番茄红素性质及功能研究
• 1.2 番茄红素的生产方法
• 1.3 番茄红素的生物合成及相关基因研究
• 1.4 光合细菌生物合成番茄红素的相关研究
• 1.5 本论文研究的目的和内容
• 1.5.1 研究的目的、意义
• 1.5.2 研究内容
• 2 Erwinia herbicola 中crtI 基因的克隆
• 2.1 材料与试剂
• 2.1.1 菌株、质粒及试剂
• 2.1.2 主要仪器设备
• 2.1.3 常用试剂配置
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 菌种的保存与复苏
• 2.2.2 E. herbicola069 菌株基因组DNA 提取
• 2.2.3 核酸质量及浓度测定
• 2.3 E. herbicola 中crtI 基因全长的克隆
• 2.3.1 E. herbicola 中crtI 基因同源片断的克隆
• 2.3.2 E. herbicola 中crtI 基因全长的克隆
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 菌种的保存与复苏
• 2.4.2 E. herbicola069 菌株基因组DNA 提取
• 2.4.3 E. herbicola 中crtI 基因同源片断的克隆
• 2.4.4 E. herbicola 中crtI 基因全长的克隆
• 2.5 讨论
• 3 生产番茄红素基因工程菌的构建
• 3.1 材料和试剂
• 3.1.1 菌株和质粒
• 3.1.2 主要仪器设备
• 3.1.3 主要化学试剂和试剂盒
• 3.1.4 实验所用试剂的配制
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 质粒DNA 的制备
• 3.2.2 表达载体pRKR5-crtI 的构建
• 3.2.3 结合转移
• 3.2.4 转化子的PCR 筛选和保存
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 表达载体pRKR5-crtI 的构建
• 3.3.2 结合转移
• 3.3.3 转化子PCR 筛选结果
• 3.4 讨论
• 4 生产番茄红素基因工程菌的鉴定分析
• 4.1 材料与试剂
• 4.1.1 菌株和试剂
• 4.1.2 主要仪器设备
• 4.1.3 常用试剂配制
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 调控氧浓度诱导重组质粒的表达
• 4.2.2 番茄红素的提取及鉴定
• 4.2.3 工程菌生长曲线和发酵曲线的研究
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 调控氧浓度诱导重组质粒的表达
• 4.3.2 番茄红素的提取及鉴定
• 4.3.3 工程菌生长曲线和发酵曲线的研究
• 4.4 讨论
• 5 结论与展望
• 5.1 主要结论
• 5.2 本论文研究的创新点
• 5.3 后续研究工作的展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录