HIV-1重组病毒载体疫苗冻干制剂的制备及其联合免疫效果的研究

论文摘要

只有疫苗才能有效的控制艾滋病的流行。同时诱导有效的细胞免疫和体液免疫是研制艾滋病疫苗的目标。为了产生更好的细胞免疫应答,近期进入临床试验的疫苗多采用DNA疫苗或重组病毒载体疫苗。而重组病毒载体疫苗主要包括修饰型安卡拉株痘病毒Modified VacciniaAnkara（MVA）载体疫苗以及腺病毒载体疫苗。但是,活病毒载体疫苗的热稳定性问题阻碍了疫苗的推广和使用。只有彻底解决疫苗的稳定性问题才能保证达到100%预防人或动物疫苗可预防疾病的目标。解决这个问题的一个行之有效的手段就是将疫苗冻干。冻干剂型的疫苗可以在常温下运输、储存,有较长的有效期,质量稳定。因此,本研究构建了表达HIV-1主要结构基因的重组MVA病毒载体疫苗和重组腺病毒载体疫苗,首次获得了热稳定性与免疫原性良好的HIV重组MVA病毒载体疫苗和重组腺病毒载体疫苗的冻干制剂及其制备工艺,并首次提出病毒载体疫苗冻干制剂“Prime-Boost”的联合免疫策略,得出先以两针HIV重组腺病毒载体疫苗冻干制剂免疫小鼠,再用一针HIV重组MVA病毒载体疫苗冻干制剂加强免疫能激发小鼠产生更强大的免疫应答,从而获得更好的免疫效果的结论。该研究将为HIV疫苗研究增加新的免疫策略,为今后艾滋病疫苗免疫程序的改进提供理论依据,也为将来在非人灵长类动物模型中的实验奠定了基础。

论文目录

• 前言
• 一、HIV病毒简介
• 1. HIV的基因组结构、主要蛋白及其功能
• 2. HIV的复制周期
• 3. HIV的分型
• 二、HIV疫苗的研究背景
• 三、HIV感染的体液免疫应答
• 四、HIV感染的细胞免疫应答
• 五、HIV疫苗研究进展
• 1. 传统疫苗
• 2. 新型疫苗
• 六、艾滋病疫苗的构建策略
• 七、新型疫苗免疫策略
• 八、病毒载体疫苗的热稳定性
• 1. MVA病毒载体稳定性的研究现状
• 2. 腺病毒载体稳定性的研究现状
• 九、药品冷冻干燥
• 1. 真空冷冻干燥的突出优点及意义
• 2. 在生物制品方面的应用
• 3. 真空冷冻干燥的原理
• 4. 冻干机的组成
• 5. 药品冻干损伤和保护机理
• 6. 冷冻干燥的程序及技术
• 第一部分 HIV重组MVA病毒载体疫苗株的构建
• 一、材料
• 二、方法
• 1. 抗原基因的选择
• 2. 重组穿梭质粒pSC11-GPE的构建
• 3. 重组痘苗病毒M-GPE的构建
• 4. 重组痘苗病毒M-GPE的鉴定
• 5. 重组痘苗病毒M-GPE体外表达鉴定
• 三、结果与讨论
• 1. 重组痘病毒M-GPE的克隆筛选
• 2. 重组痘病毒M-GPE插入序列的鉴定
• 3. 重组痘病毒M-GPE抗原性研究
• 第二部分 HIV重组腺病毒载体疫苗株的构建
• 一、材料
• 二、方法
• 1. 重组腺病毒质粒Ad-gagpol的构建
• 2. 重组腺病毒 Ad-gagpol 的鉴定
• 三、结果与讨论
• 1. 穿梭质粒pShutle-gagpol的酶切鉴定
• 2. 重组腺病毒载体质粒Ad-gagpol的酶切鉴定
• 3. Pac Ⅰ酶切重组腺病毒载体质粒Ad-gagpol
• 4. 线性化重组腺病毒载体Ad-gagpol质粒转染HEK293 细胞
• 5. Western blot检测外源基因的表达
• 第三部分 HIV重组MVA载体疫苗冻干制剂及其制备工艺的研究
• 一、材料
• 二、方法
• 1. 液体M-GPE病毒疫苗的扩增、纯化
• 2. 实验分组
• 3. 冻干重组M-GPE疫苗的制备
• 4. 残余水分含量测定
• 5. 感染性滴度测定
• 6. 热稳定性的监测
• 7. 冻干M-GPE疫苗的抗原性研究
• 8. 免疫小鼠
• 9. 间接ELISA检测小鼠抗-P24 抗体
• 10. Western blot检测血清抗体
• 11. CTL检测
• 三、结果和讨论
• 1. 共晶点的测定
• 2. 物理性状检查
• 3. 冻干保护剂组合的热稳定性
• 4. 残余水分含量
• 5. 复溶后的冻干苗的热稳定性
• 6. 冻干M-GPE的抗原性
• 7. 冻干M-GPE疫苗的安全性
• 8. 体液免疫
• 9. CTL检测
• 第四部分 HIV重组腺病毒载体疫苗冻干制剂及其制备工艺的研究
• 一、材料
• 二、方法
• 1. 腺病毒载体疫苗Ad-gagpol的扩增
• 2. 腺病毒载体疫苗Ad-gagpol的纯化
• 3. 试验分组
• 4. 冻干重组腺病毒疫苗Ad-gagpol的制备
• 5. 残余水分含量测定
• 6. 滴度测定
• 7. 热稳定性试验
• 8. 复溶后的冻干苗的热稳定性
• 9. 冻干重组腺病毒疫苗的抗原性研究
• 10. 免疫小鼠
• 11. Western blot检测血清抗体
• 12. 鼠IFN-γELISPOT检测
• 三、结果和讨论
• 1. 共晶点的测定
• 2. 物理性状检查
• 3. 热稳定性的监测
• 4. 残余水分含量
• 5. 复溶后的冻干苗的热稳定性
• 6. 冻干重组Ad-Gagpol疫苗的抗原性
• 7. 体液免疫
• 8. 鼠IFN-γ ELISPOT
• 第五部分 HIV重组病毒载体疫苗冻干制剂联合免疫的策略
• 一、材料
• 二、方法
• 1. 免疫小鼠
• 2. Western blot检测血清抗体
• 3. 鼠IFN-γ Elispot检测细胞免疫
• 三、结果和讨论
• 1. 体液免疫
• 2. 细胞免疫
• 小结
• 参考文献
• 致谢
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 作者简历