论文摘要
牛奶及其乳清中含有大量的乳糖,世界上平均70%～90%的成年人（尤其是亚洲和非洲人）喝牛奶后会产生乳糖不耐受,这在很大程度上限制了人们对乳及乳制品的摄入。β-半乳糖苷酶可将乳及乳清中的乳糖水解,降低乳糖含量,提高乳及乳制品的营养价值和利用率,解决乳糖不耐受患者的乳品消费问题,同时还可去除乳清浓缩时乳糖结晶析出给乳制品加工带来的不便。另外,牛乳和人乳在组成上是有差别的。人乳蛋白主要是乳清蛋白,约占总蛋白的70%,其他的为酪蛋白。而牛乳蛋白主要是酪蛋白,约占总蛋白的78.8%,乳清蛋白含量低,约占总蛋白的21.2%。所以,改良牛乳的蛋白组成和含量,使之更接近于人乳,会提高牛乳的营养价值。用转基因技术改变乳成分来提高乳的营养价值和加工特性,包括提高乳中高价值成分的浓度、消除乳中不理想成分、生产人乳中一些成分以及利用乳腺生物反应器来生产药物蛋白,将为整个乳业生产带来一场变革。α-乳白蛋白是一种主要的乳清蛋白,具有调节产乳的功能,是必需氨基酸和支链氨基酸的极好来源,也是唯一能与金属包括钙结合的乳清蛋白成分。另外,它还有抑菌、抑制细胞凋亡、增强大脑反应能力等多种功能。本研究旨在通过基因重组技术构建真核表达载体,使人α-乳白蛋白基因和β-半乳糖苷酶基因在奶牛乳腺上皮细胞中高效表达,一方面降低乳糖含量,另一方面产生活性人α-乳白蛋白。目的在于进一步使人α-乳白蛋白基因和β-半乳糖苷酶基因在奶牛乳腺中高水平表达,为今后制备转基因动物生产转基因牛奶、改良牛奶品质提供可行的技术手段和可信的理论支持。本研究PCR扩增了牛αS1-酪蛋白5′调控序列约1.2kb的片段,合成了0.76kb的人α-乳白蛋白的基因（α-LA）cDNA序列。应用基因重组技术,以含SV40启动子调控下β-半乳糖苷酶基因（LacZ）的PSV为载体,连接牛αS1-酪蛋白5′调控序列约1.2kb的片段为启动子,在其后连接0.76kb的人α-乳白蛋白基因cDNA序列,构建了双基因真核表达载体αS1-LA-psv。将人α-乳白蛋白（α-LA）0.76kb的cDNA序列连接到PSV载体SV40启动子后（去LacZ基因）,构建了SV40启动子调控下人α-乳白蛋白单基因真核表达载体LA-cDNA-psv;培养了牛乳腺上皮细胞,纯化后,用免疫荧光细胞染色法对纯化的牛乳腺上皮细胞进行了角蛋白18鉴定,从而确定培养纯化的细胞为奶牛乳腺上皮细胞。本研究用阳离子脂质体将构建的双基因真核表达载体αS1-LA-psv转染奶牛乳腺上皮细胞。应用两种方法检测出了β-半乳糖苷酶在奶牛乳腺上皮细胞中的表达。一种方法是细胞原位染色法,表达的β-半乳糖苷酶催化X-Gal分解,在显微镜下观察到培养的细胞中生成了深蓝色产物。另一种方法是用Promega生产的Beta-Glo E2000检测系统,检测转染后不同时期细胞培养液和细胞裂解液中β-半乳糖苷酶的表达情况,结果显示转染24h～120h的细胞培养液和细胞裂解液中均检测到了β-半乳糖苷酶的表达。其中在细胞破碎液中,转染后24h就可以检测到lacZ基因的表达,转染72h表达量最高,之后表达水平有逐渐降低的趋势,144h降到最低,基本检测不到酶活性。在细胞培养液中,转染后24h也可以检测到lacZ基因的表达,但表达量明显低于细胞破碎液,之后表达水平有逐渐升高的趋势,48h达到最高,随后开始降低,144h也基本检测不到酶活性。将转染细胞传代后检测β-半乳糖苷酶的表达情况,结果传到第三代时基本检测不到酶活性。应用高效液相色谱（HLPC）检测了转染后不同时期细胞破碎液中β-半乳糖苷酶的表达所引起的细胞中乳糖含量的变化,结果显示转染24h乳糖含量变化不大,转染48～144h乳糖含量显著减少,且在48h至72h乳糖的减少量最多,与β-半乳糖苷酶的含量检测结果相符。转染后,应用Western Blot方法检测了人α-乳白蛋白的表达,结果显示转染72h的细胞裂解液中检测到了人α-乳白蛋白的表达,表达量约为0.64mg/mL。本研究还将构建的SV40启动子调控下人α-乳白蛋白基因的单基因真核表达载体LA-cDNA-psv用阳离子脂质体转染法转染奶牛乳腺上皮细胞,也应用Western Blot方法检测到了转染72h人α-乳白蛋白的表达,表达量约为0.85mg/mL。实验结果表明培养的牛乳腺上皮细胞具有外源基因表达活性;得到的牛αS1-酪蛋白5′调控序列能作为启动子指导外源基因在牛乳腺上皮细胞高效表达;构建的双基因真核表达载体αS1-LA-psv能在体外培养的牛乳腺上皮细胞中高效表达人α-乳白蛋白和β-半乳糖苷酶;构建的单基因真核表达载体LA-cDNA-psv能在体外培养的牛乳腺上皮细胞中高效表达人α-乳白蛋白。本研究还用阳离子脂质体将构建的双基因真核表达载体αS1-LA-psv通过体外多点注射的方法转染健康泌乳奶牛乳腺,检测转染后乳产量和乳糖含量变化。结果显示转染后24h～120h均检测到了牛乳中乳糖含量的显著降低,乳产量变化不明显,表明构建的双基因真核表达载体αS1-LA-psv能够在牛乳腺组织细胞中表达目的基因,产生低乳糖乳,且外源基因的转染不会影响奶牛的正常泌乳。